小鼠間充質(zhì)祖細(xì)胞體外優(yōu)化培養(yǎng)及向神經(jīng)元樣細(xì)胞定向誘導(dǎo)分化的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：對(duì)體外培養(yǎng)C57小鼠密質(zhì)骨來(lái)源的間充質(zhì)祖細(xì)胞（mesenchymal progenitor cells，MPC）的方法進(jìn)行研究，建立適合小鼠MPC增殖的培養(yǎng)方案；探討小鼠密質(zhì)骨來(lái)源的MPC體外向神經(jīng)元樣細(xì)胞定向誘導(dǎo)分化的實(shí)驗(yàn)研究。 方法： 取材方法選擇健康C57雌性小鼠，清潔級(jí)，3周齡，18±2g，取股骨、脛骨碎片經(jīng)Ⅱ型膠原蛋白酶消化后作為MPC來(lái)源。 分組取得消化后的骨碎片，選取干細(xì)胞培養(yǎng)中經(jīng)常使用的DM

2、EM/F12培養(yǎng)基、IMDM培養(yǎng)基、α-MEM培養(yǎng)基和TBD公司生產(chǎn)的胎牛血清（FCS）、GIBCO公司生產(chǎn)的胎牛血清，按不同搭配進(jìn)行培養(yǎng)，隨機(jī)分為DMEM/F12+10％TBD胎牛血清組、DMEM/F12+10％GIBCO胎牛血清組、IMDM+10％TBD胎牛血清組、IMDM+10％GIBCO胎牛血清組、α-MEM+10％TBD胎牛血清組、α-MEM+10％GIBCO胎牛血清組，共6組，每組培養(yǎng)6份。 培養(yǎng)方法將小鼠密質(zhì)骨碎片

3、置入六孔板中，按不同分組加入相應(yīng)培養(yǎng)液，放入37℃、5％ CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)，48 h后首次換液，以后每隔2-3 d換液一次。每天觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況，當(dāng)生長(zhǎng)最好的實(shí)驗(yàn)組原代（P0）細(xì)胞細(xì)胞貼壁超過(guò)培養(yǎng)板底面積80％時(shí)吸出培養(yǎng)液，用含0.04％EDTA的0.25％胰蛋白酶消化、收集細(xì)胞，按固定細(xì)胞濃度傳入培養(yǎng)瓶。傳代后以后每2-3 d換液一次，當(dāng)生長(zhǎng)最好的實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞貼壁超過(guò)培養(yǎng)瓶底面積70％-80％時(shí)按固定細(xì)胞濃度1×103個(gè)/c㎡傳代。

4、 MPC純度鑒定采用流式細(xì)胞術(shù)分析，單標(biāo)法檢測(cè)第三代（P3）MPC，取FITC標(biāo)記的兔抗鼠CD29、CD31、CD44、CD90和PE標(biāo)記的兔抗鼠CD45、CD106作為標(biāo)記物，平行對(duì)照組為加入同型對(duì)照抗體的MPC。考慮到實(shí)驗(yàn)的需要以及研究生學(xué)習(xí)階段時(shí)間有限，只選擇采用優(yōu)化方案進(jìn)行培養(yǎng)的MPC進(jìn)行純度鑒定。 MPC的多向分化鑒定對(duì)MPC進(jìn)行向骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞的定向誘導(dǎo)分化，驗(yàn)證其具有干細(xì)胞的多向分化潛能，用茜素紅和油紅O

5、染色檢測(cè)誘導(dǎo)分化結(jié)果。同樣只選擇采用優(yōu)化方案進(jìn)行培養(yǎng)的MPC進(jìn)行多向分化能力鑒定。 MPC定向誘導(dǎo)成神經(jīng)元樣細(xì)胞的方法取優(yōu)化方案培養(yǎng)的P4代MPC，用微環(huán)境體液（神經(jīng)元原代培養(yǎng)上清液）進(jìn)行誘導(dǎo)，取誘導(dǎo)24h后的MPC作為實(shí)驗(yàn)標(biāo)本。對(duì)其進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察；免疫細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)神經(jīng)元特異性標(biāo)志物神經(jīng)元特異性烯醇化酶（neuron specific enolase，NSE）及神經(jīng)絲蛋白（neurofilament protein，NF）的表

6、達(dá)情況，同時(shí)進(jìn)行免疫熒光分析。 結(jié)果： C57小鼠間充質(zhì)祖細(xì)胞（MPC）體外優(yōu)化培養(yǎng) 原代培養(yǎng)Sd后，可見培養(yǎng)器皿底部有細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)，以圓形和扁圓形為主，10d后貼壁細(xì)胞逐漸鋪開，形成梭形或多角形，形態(tài)飽滿，折光性強(qiáng)，細(xì)胞間無(wú)重疊，有接觸抑制現(xiàn)象；傳代后細(xì)胞形態(tài)趨于一致，大部分為梭形，排列緊密，生長(zhǎng)旺盛。當(dāng)某個(gè)實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞貼壁超過(guò)底面積70％-80％時(shí)，對(duì)所有細(xì)胞進(jìn)行傳代計(jì)數(shù)，觀察3代。結(jié)果發(fā)現(xiàn)在每一代的細(xì)胞計(jì)數(shù)

7、中，DMEM/F12+10％ GIBCO胎牛血清組的細(xì)胞數(shù)量都超過(guò)其他各組，通過(guò)統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)驗(yàn)證DMEM/F12+10％ GIBCO胎牛血清組細(xì)胞數(shù)量與其余各組相比有顯著差異（P<0.05）。說(shuō)明DMEM/F12+10％GIBCO胎牛血清更有利于MPC的體外培養(yǎng)增殖。 MPC純度鑒定 優(yōu)化方案培養(yǎng)的MPC表達(dá)間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記CD29、CD44、CD90和CD106，不表達(dá)造血細(xì)胞標(biāo)記CD31和CD45。說(shuō)明得到的是同源性好、

8、純度高、排除了造血干細(xì)胞影響的MPC。 MPC多向分化能力鑒定 在用優(yōu)化方案培養(yǎng)的MPC定向誘導(dǎo)成骨細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)中，通過(guò)茜素紅染色發(fā)現(xiàn)誘導(dǎo)后細(xì)胞外基質(zhì)中大量鈣鹽沉積；在定向誘導(dǎo)成脂肪細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)中，通過(guò)油紅O染色發(fā)現(xiàn)細(xì)胞中出現(xiàn)的脂滴被染成點(diǎn)狀紅色，表明我們得到的MPC能向骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞分化。說(shuō)明我們得到的是活性好、具有多向分化能力的MPC。 MPC體外向神經(jīng)元樣細(xì)胞定向誘導(dǎo)分化 經(jīng)誘導(dǎo)24h后，MPC細(xì)

9、胞形態(tài)發(fā)生變化，自胞體有突起長(zhǎng)出，各細(xì)胞突起長(zhǎng)短不一，類似神經(jīng)元。免疫細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)結(jié)果表明，誘導(dǎo)后MPC的NSE（73.73％±9.88％）及NF（60.26％±7.19％）均陽(yáng)性表達(dá)；免疫熒光檢測(cè)也證實(shí)免疫細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)的結(jié)果。 結(jié)論: 1.實(shí)驗(yàn)證明，用DMEM/F12+10％ GIBCO胎牛血清為培養(yǎng)液進(jìn)行小鼠密質(zhì)骨來(lái)源的MPC體外培養(yǎng)最有利于其數(shù)量的擴(kuò)增，得到的是同源性好、純度高、增殖活力強(qiáng)、具有多向分化潛能的MPC