DLBCL中SIRT1蛋白表達與基因異常及其對細胞生物學行為的影響.pdf

1、背景：
　　彌漫性大B細胞淋巴瘤(Diffuse Large B Cell Lymphoma,DLBCL)是非霍奇金淋巴瘤中最常見且高度惡性的一種淋巴造血系統(tǒng)惡性腫瘤,占全部非霍奇金淋巴瘤的30-40％。在臨床表現(xiàn)、形態(tài)學和遺傳學表型上具有較大異質(zhì)性,其分子機制尚不清楚,有待深入探討。SIRT1基因(酵母沉默信息調(diào)節(jié)因子Sir2的同源基因)位于10q21.3,大小約33kb,編碼一種重要的依賴于煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)的組

2、蛋白去乙?；?是由747個氨基酸構(gòu)成的細胞生存調(diào)控蛋白。多項研究顯示SIRT1通過去乙?；M蛋白和一系列非組蛋白如P53,FOX0,Ku70,P300等從而發(fā)揮其延長細胞生命周期,抵御氧化應激損傷和保持基因組穩(wěn)定的功能,因此又被稱為長壽基因。但在惡性腫瘤中,SIRT1由于能抑制抑癌基因的轉(zhuǎn)錄活性等機制被認為是重要的腫瘤促進因子,FOXO(Forkhead box classO)轉(zhuǎn)錄因子是SIRT1的重要靶蛋白,受到SIRT1的去乙酰化

3、調(diào)節(jié)改變其下游通道活性,從而影響細胞增殖凋亡狀態(tài)。SIRT1的表達異常在前列腺癌、乳腺癌、皮膚癌等多種惡性腫瘤中均有相關(guān)報道,體內(nèi)外實驗證實抑制SIRT1表達或活性可誘導細胞生長阻滯或凋亡。關(guān)于SIRT1在DLBCL中的蛋白表達國外有1篇報道,但尚未見SIRT1基因狀態(tài)及SIRT1在體外對DLBCL細胞株生物學行為影響的報道,國內(nèi)也未見相關(guān)報道。
　　目的：
　　觀察SIRT1在DLBCL中的蛋白表達和基因狀態(tài)及其臨床病理學

4、意義,分析兩者的相關(guān)性,并進一步在體外觀察慢病毒介導的SIRT1基因沉默對細胞生物學行為的影響。
　　方法：
　　一、收集復旦大學附屬腫痛醫(yī)院病理科1995年-2004年間本院活檢為DLBCL的138例和淋巴組織反應性增生(Reactive Lymphoid Hyperplasia,RLH)的15例石蠟標本制成組織芯片,另增加6例RLH的單獨制片,每例均由復旦大學附屬腫瘤醫(yī)院病理科兩位病理醫(yī)生復片,根據(jù)組織學形態(tài)和免疫組化特

5、點(包括bcl-6、MUM1、CD10)進行診斷,診斷依據(jù)參照世界衛(wèi)牛組織最新分類標準。絕大多數(shù)病例都有年齡、性別、原發(fā)部位、臨床分期、國際預后指數(shù)(Internat ional Prognostic Index,IPI)、血清乳酸脫氫酶(LactateDehydrogenase,LDH)值及組織學分型等臨床特征數(shù)據(jù)。其中有67例有預后隨訪資料。隨訪時間2-120個月,截止至2009年12月份。
　　二、采用免疫組織EnVisio

6、n兩步法,應用抗人SIRT1和FOX03a單克隆兔IgG抗體觀察SIRT1和FOX03a在DLBCL中的蛋白表達和分布特征及其臨床病理意義,進一步分析兩者之間存在的相關(guān)性及與預后的聯(lián)系;
　　三、選用含有SIRT1基因全長序列的細菌人工染色體(Bacterial ArtificialChromosome,BAC)質(zhì)粒的大腸桿菌單克隆擴增后提取質(zhì)粒,經(jīng)驗證后用缺口平移法熒光標記SIRT1基因的雜交探針,熒光原位雜交法(Fluores

7、cence InSitu Hybridiazaition,FISH)檢測DLBCL、RLH及DLBCL細胞株ly1和ly8中SIRT1的基因異常情況,并分析與其蛋白表達之間的關(guān)聯(lián)。
　　四、CCK8染色法檢測DLBCL細胞株ly1和ly8的增殖情況,Western blotting檢測隨著細胞增殖SIRTI和FOX03a蛋白含量的變化。利用RNAi和慢病毒轉(zhuǎn)基因技術(shù),構(gòu)建pMagic4.0-SIRT1質(zhì)粒,使它和pRsv-REV,

8、pMD1g-pRRE,pMD2G組成慢病毒四質(zhì)粒轉(zhuǎn)染系統(tǒng),共轉(zhuǎn)染293T細胞,生產(chǎn)EGFP-SIRT1病毒。相應構(gòu)建EGFP-NC空載體病毒作為陰性對照。用EGFP-NC、EGFP-SIRT1病毒分別感染ly1和ly8細胞,獲取混合克隆,采用流式細胞儀篩選穩(wěn)定表達EGFP-SIRT1、EGFP-NC的克隆,Western blotting檢測SIRT1蛋白量判定干擾效率,比較分析SIRT1干擾組與對照組ly1和ly8的生物學行為的改變,

9、采用CCK8染色法測定細胞增殖能力、流式細胞儀檢測細胞周期和凋亡,以及用western blotting檢測FOX03a,凋亡相關(guān)蛋白Caspase-3、Caspase-8和Caspase-9的蛋白含量變化。
　　結(jié)果：
　　一、DLBCL的臨床特征:該組DLBCL病例的發(fā)病年齡9-85歲,中位年齡47歲,其中男性74例,女性63例。59歲及以下的80例,59歲以上56例。原發(fā)于結(jié)內(nèi)86例,結(jié)外51例,其中原發(fā)于胃腸30例。

10、臨床分期Ⅰ期30例,Ⅱ期42例,Ⅲ期27例,Ⅳ期6例。國際預后指數(shù)(International PrognosticIndex,IPI)0-2分74例,大于2分的19例。LDH水平正常的47例,升高的35例。根據(jù)Hans等人的TMA判斷法,將DLBCL分為GCB(Germinal centerB-cell)51例(37％),non-GCB(Nongerminal center B-cell)87例(63％)。截止到2009.12.10,

11、有隨訪資料的67例DLBCL患者中25例死亡,最長的存活期至今有10年。
　　二、免疫組織化學結(jié)果:1.SIRT1在RLH中的陽性率為30％(6/20),明顯低于在DLBCL中的陽性率67.2％(92/137)(P<0.01);2.FOX03a在RLH中主要在套區(qū)和套間增殖較不活躍的細胞中陽性表達,而生發(fā)中心的陽性細胞數(shù)少,表達較弱,FOX03a的總陽性率為90％(18/20)。在DLBCL中陽性細胞呈均一分布,總陽性率為81.7

12、％(107/131)。兩者無顯著統(tǒng)計學意義(P>0.05);3.FOX03a在RLH中的強陽(+++)率為50％(10/20),在DLBCL中的強陽(+++)率為8.4％(11/131),兩者具有顯著統(tǒng)計學差異(P(0.01):4.SIRT1和FOX03a蛋白在RLH中的表達無關(guān)(P>0.05);在DLBCL中兩者表達呈正相關(guān)(x2=7.316,γ=0.237,P<0.01);5.SIRT1在原發(fā)于胃腸的結(jié)外DLBCL中比其它結(jié)外或結(jié)內(nèi)

13、原發(fā)的DLBCL的蛋白表達率明顯增高(P<0.05),而與患者的年齡、性別、組織學分型、臨床分期等其他臨床特征均無關(guān)(P>0.05);6.SIRT1蛋白表達與DLBCL的預后未見明顯相關(guān)(P>0.05)。
　　三、FISH結(jié)果:1.一共有127例BLBCL存在FISH信號,3例有SIRT1基因擴增,陽性率2.4％,33例為SIRT1基因低倍體(3-4倍體),占26.0％。6例為SIRT1基因高倍體(5倍及以上),占4.7％,即共有

14、42例發(fā)生SIRT1基因數(shù)目異常(包括基因擴增或基因多倍體),約占所有DLBCL的33.1％;2.DLBCL中SIRT1基因數(shù)目異常和其蛋白表達之間呈正相關(guān)(γ=0.281,P=0.001);3.15例RLH中存在FISH信號,均未發(fā)現(xiàn)有SIRT1基因擴增或多倍體的現(xiàn)象;4.ly1和ly8細胞中均存在FISH信號,少于5％的細胞中見有SIRT1基因多倍體。
　　四、體外研究的結(jié)果:1.SIRT1在DLBCL細胞株ly1和ly8傳代

15、后增殖早期表達水平較高,增殖后期表達水平降低;2.慢病毒EGFP-SIRT1轉(zhuǎn)染后穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞的篩選使ly1和ly8中SRIT1蛋白表達率相對于陰性對照分別下降78％和75％:3.SIRT1基因沉默對DLBCL細胞株ly1和ly8的周期和增殖能力未見有明顯影響:4.SIRT1基因沉默可誘導DLBCL細胞株ly1和ly8凋亡,并上調(diào)細胞凋亡相關(guān)因子caspase3、caspase8和9,而FOX03a蛋白表達水平未見有明顯改變。
　　結(jié)

16、論：
　　一、SIRT1在DLBCL中的蛋白表達陽性率要明顯高于RLH,提示SIRT1參與了DLBCL的發(fā)生機制:
　　二、FOX03a在DLBCL中的蛋白表達強陽性率要明顯低于在RLH中,提示FOX03a潛在的抑癌作用;
　　三、SIRT1和FOX03a的蛋白表達在DLBCL中正相關(guān),在RLH中則沒有關(guān)聯(lián),提示FOX03a表達和功能的調(diào)控可能是SIRT1的重要促癌機制之一;
　　四、胃腸原發(fā)的DLBCL中SIR