沉默Gpc3基因?qū)Ω伟┘毎飳W(xué)行為的影響.pdf

1、前言:
　　肝細胞肝癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是最常見的消化道惡性腫瘤之一，位居全球癌癥相關(guān)性死因的第三位，特別是在發(fā)展中國家。HCC的發(fā)生是多基因多步驟的過程，涉及許多增殖、凋亡相關(guān)基因的改變。HCC與潛在的血管侵襲、轉(zhuǎn)移相關(guān)，多數(shù)HCC患者診斷時已處于晚期失去了手術(shù)的機會，導(dǎo)致HCC的五年生存率較低、預(yù)后較差。因此，對肝細胞肝癌的早期診斷及治療提出了迫切的要求。
　　磷脂酰肌醇蛋白聚糖

2、-3（Glypican-3，GPC3）是一種新的肝細胞肝癌腫瘤標志物，對肝癌的診斷及治療具有重要意義，是硫酸乙酰肝素蛋白聚糖家族的一員，由胎兒肝臟產(chǎn)生，在胚胎發(fā)育期調(diào)節(jié)細胞的增殖及存活。GPC3基因在HCC發(fā)生過程中可能通過參與不同的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路而調(diào)節(jié)細胞的增殖、凋亡、侵襲粘附及分化能力。GPC3基因在HCC中特異性高表達而在正常組織及癌旁組織中幾乎不表達或低表達的特性使其成為HCC新的腫瘤標志物及潛在基因治療靶點。
　　慢病毒載

3、體介導(dǎo)的RNA干擾(RNA interference，RNAi)就是將慢病毒載體高效感染和整合的特性與RNA干擾特異性抑制同源基因表達的作用相結(jié)合。慢病毒載體解決了RNAi容易被降解，性質(zhì)不穩(wěn)定，細胞攝取率不高及在細胞內(nèi)表達的安全性等問題。
　　本研究擬通過應(yīng)用慢病毒載體介導(dǎo)的RNA干擾技術(shù)，使肝癌細胞中GPC3基因的表達下調(diào)，觀察沉默GPC3基因?qū)Ω伟┘毎鲋?、凋亡、侵襲、遷移能力的影響，進而探索GPC3基因在肝癌的發(fā)生發(fā)展中所

4、起的作用。
　　材料與方法:
　　一、實驗材料
　　細胞株:肝癌HepG2細胞株購自中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細胞庫。293T細胞株由本室保存。
　　二、研究方法
　　1、構(gòu)建沉默GPC3基因的慢病毒載體，并穩(wěn)定轉(zhuǎn)染肝癌HepG2細胞。
　　2、應(yīng)用RT-PCR，Western blot分別從mRNA和蛋白水平檢測轉(zhuǎn)染前后GPC3基因在肝癌細胞中表達情況的變化。
　　3、細胞增殖實驗檢測轉(zhuǎn)染后

5、肝癌細胞的增殖能力的變化。
　　4、流式細胞術(shù)檢測轉(zhuǎn)染后肝癌細胞凋亡能力的變化。
　　5、Transwell侵襲小室、細胞劃痕實驗檢測轉(zhuǎn)染后肝癌細胞的侵襲遷移能力的變化。
　　6、統(tǒng)計學(xué)處理:實驗至少重復(fù)3次，采用SPSS17.0軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，數(shù)據(jù)結(jié)果以(x)±s表示，以P＜0.05為判斷差異顯著性標準。
　　結(jié)果:
　　1、經(jīng)酶切鑒定，測序結(jié)果表明GPC3-shRNA慢病毒載體構(gòu)建正確，并測定滴

6、度為1×108TU/ml。最適感染復(fù)數(shù)(MOI)為10，最佳感染時間為72h。
　　2、轉(zhuǎn)染后，轉(zhuǎn)染組GPC3基因的mRNA及蛋白表達較陰性對照組及空白對照組下調(diào)。
　　3、沉默GPC3基因的轉(zhuǎn)染組較陰性對照組及空白對照組相比，增殖能力下降。
　　4、轉(zhuǎn)染后，肝癌細胞的凋亡細胞數(shù)較陰性對照組及空白對照組增加。
　　5、轉(zhuǎn)染后經(jīng)過48h的培養(yǎng)，肝癌細胞穿過matrigel膠的細胞數(shù)較陰性對照組及空白對照組相比減少，

7、遷移的速度較陰性對照組及空白對照組減慢。
　　結(jié)論:
　　1、成功構(gòu)建了GPC3-shRNA慢病毒載體。
　　2、慢病毒載體介導(dǎo)的RNA干擾，能穩(wěn)定的轉(zhuǎn)染肝癌細胞，并在mRNA及蛋白水平下調(diào)肝癌細胞中GPC3基因的表達。
　　3、沉默肝癌細胞中的GPC3基因的表達，可抑制肝癌細胞的增殖，誘導(dǎo)肝癌細胞的凋亡，降低肝癌細胞對matrigel膠的粘附能力，降低其侵襲遷移能力。
　　4、GPC3基因在肝細胞肝癌中起