Astrocyte elevated gene-1在神經(jīng)母細胞瘤中的表達及基因沉默對細胞生物學行為的影響.pdf

1、第一部分: AEG-1在神經(jīng)母細胞瘤中的表達及其對預后的影響 1.目的: （1）檢測AEG-1在神經(jīng)母細胞瘤中的表達 （2）研究AEG-1的表達與神經(jīng)母細胞瘤臨床病理參數(shù)的關系及其對預后的影響 （3）明確AEG-1在神經(jīng)母細胞瘤細胞中的定位 2.材料與方法: （1）收集病例資料：收集山東大學齊魯醫(yī)院接受手術并病理證實的神經(jīng)母細胞瘤標本32例，詳細記錄病人的資料，并進行隨訪。 （2）研究AE

2、G-1在神經(jīng)母細胞瘤組織的表達：免疫組織化學法。 （3）明確AEG-1在神經(jīng)母細胞瘤細胞中的定位：免疫熒光標記法。 3.結果: （1）AEG-1在神經(jīng)母細胞瘤組織中是高表達的，75％（24/32例）標本為陽性表達。 （2）對32例神經(jīng)母細胞瘤患者的臨床資料進行x2檢驗，研究AEG-1與臨床病理參數(shù)之間的關系。年齡<1歲的患者中AEG-1陽性率為37.5％（3/8），年齡≥1歲患者中AEG-1陽性率為87.5％（

3、21/24），二者相比有顯著性差異（P=0.012），年齡≥1歲組AEG-1表達水平高于年齡<1歲組；男性患者中AEG-1陽性率為77.8％（14/18），女性患者中AEG-1陽性率為71.4％（10/14），二組無顯著性差異（P=0.703）；原發(fā)部位為腎上腺的患者中AEG-1陽性率為78.9％（13/19），發(fā)病部位為腎上腺以外的患者中AEG-1陽性率為69.2％（11/13），二組無顯著性差異（P=0.420）；處于疾病早期（Ea

4、rly stage）（Ⅰ+Ⅱ+Ⅳs）的患者中AEG-1陽性率為50％（5/10），處于進展期（Advanced stage）（Ⅲ+Ⅳ）患者中AEG-1陽性率為90％（18/20），二組相比有顯著性差異（p=0.03），進展期AEG-1表達水平高于早期；根據(jù)國際神經(jīng)母細胞瘤病理分型，組織結構良好型（Favourable histology，F(xiàn)H）的患者中AEG-1陽性率為58.8％（10/17），組織結構不良型（Unfavourable

5、histology，UFH）患者中AEG-1陽性率為93.3％（14/15），二組相比有顯著性差異（P=0.041），UFH患者AEG-1表達水平高于FH。 （3）Spearman相關性分析，AEG-1表達與患者的發(fā)病年齡（r=0.404，P=0.022）、臨床分期（r=0.447，P=0.010）、病理分型（r=0.389，P=0.024）呈正相關。 （4）對32例神經(jīng)母細胞瘤患者進行單因素Kaplan-Meier分析，再

6、用Log-rank檢驗兩組生存率的統(tǒng)計意義，研究與神經(jīng)母細胞瘤預后相關的因素。 （5）Cox多因素分析結果，國際神經(jīng)母細胞瘤病理分型是影響神經(jīng)母細胞瘤病人預后的獨立因素（P=0.022）；AEG-1的表達（P=0.176），年齡（P=0.247），臨床分期（P=0.694）不是影響神經(jīng)母細胞瘤病人預后的獨立因素。 （6）AEG-1在神經(jīng)母細胞瘤的細胞漿和細胞膜表達，在細胞核內(nèi)沒有AEG-1的表達。 4.結論:

7、（1）AEG-1在神經(jīng)母細胞瘤組織中是高表達的，75％（24/32例）標本為陽性表達。 （2）AEG-1的表達在不同的發(fā)病年齡、臨床分期、病理類型的患者之間有顯著性差異，而在不同的性別、不同發(fā)病部位的患者之間沒有顯著性差異。 （3）Spearman相關性分析，AEG-1表達與患者的發(fā)病年齡、臨床分期、病理分型呈正相關。 （4）對32例神經(jīng)母細胞瘤患者進行單因素Kaplan-Meier分析，再用Log-rank檢驗兩組生

8、存率的統(tǒng)計意義。AEG-1的表達、病人的發(fā)病年齡、臨床分期和病理分型對患者預后的影響具有統(tǒng)計學意義，而病人的性別和起病的部位對患者的預后沒有影響。 （5）Cox多因素分析結果，病理分型是影響神經(jīng)母細胞瘤病人預后的獨立因素。 （6）AEG-1在神經(jīng)母細胞瘤的細胞漿和細胞膜表達，在細胞核內(nèi)沒有AEG-1的表達。 第二部分:慢病毒介導的神經(jīng)母細胞瘤細胞AEG-1基因沉默 目的: （1）構建AEG-1 RNA干

9、擾慢病毒載體 （2）篩選AEG-1基因沉默的細胞株 （3）比較AEG-1基因沉默的效果 材料與方法: （1）AEG-1 RNA干擾慢病毒載體的構建：采用Invitrogen公司的BLOCK-iTLentiviral RNAi Expression System，構建入門克隆和病毒包裝目的質(zhì)粒。 （2）RNA干擾慢病毒的生產(chǎn)和滴度測定：四種質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293FT的方式生產(chǎn)病毒，病毒功能滴度測定用轉(zhuǎn)導試驗，分

10、子滴度測定用定量PCR技術。 （3）基因沉默細胞株的篩選：慢病毒轉(zhuǎn)導M17和SK-N-SH細胞后用Blasticidin篩選，建立AEG-1基因沉默細胞株和對照細胞株。 （4）細胞瞬時轉(zhuǎn)染實驗：用Lipofectamine2000進行轉(zhuǎn)染試驗，評價RNAi效果。 （5）AEG-1 mRNA表達水平的分析：定量RT-PCR。 （6）AEG-1蛋白表達水平的檢測：Western Blot分析。 3.結果:

11、 （1）成功構建AEG-1RNAi入門質(zhì)粒，兩個針對不同序列的RNAi質(zhì)粒均有顯著的干擾效果，AEG-1mRNA抑制效果分別達53.7％和61.1％。 （2）包裝產(chǎn)生的濃度為2×1010copies/ml的Lenti6-AEG-1和Lenti6-NS轉(zhuǎn)導M17、SK-N-SH細胞的功能滴度分別為：1.8×106TU/ml、1.2×106TU/ml和1.7×106TU/ml、1.2×106TU/ml。 （3）成功篩選出AEG

12、-1基因沉默的M17/AEG-1（-）和SK-N-SH/AEG-1（-）細胞，同時建立非特異性對照細胞M17/NS和SK-N-SH/NS。 （4）M17/AEG-1（-）和SK-N-SH/AEG-1（-）的AEG-1mRNA水平約下降80％，M17/NS和SK-N-SH/NS的AEG-1mRNA水平與親本細胞相比無明顯改變；M17/AEG-1（-）和SK-N-SH/AEG-1（-）的AEG-1蛋白質(zhì)水平約下降90％。 4.

13、結論: （1）成功構建AEG-1 shRNA表達質(zhì)粒，并比較針對不同靶序列的RNAi質(zhì)粒的效果，確定RNAi效果較好的靶序列。 （2）采用BLOCK-iT慢病毒RNA干擾系統(tǒng)，成功構建并包裝生產(chǎn)較高滴度的慢病毒載體。 （3）應用病毒轉(zhuǎn)導加Blasticidin篩選的方式，成功建立AEG-1基因穩(wěn)定沉默的M17和SK-N-SH細胞及非特異性病毒轉(zhuǎn)導細胞。 （4）定量RT-PCR和Western Blot分析結果表明

14、篩選細胞AEG-1基因mRNA水平顯著抑制，蛋白質(zhì)水平明顯下降。 第三部分:AEG-1基因沉默對神經(jīng)母細胞瘤的生物學行為的影響 1.目的: （1）觀察AEG-1基因沉默對細胞增殖的影響 （2）分析AEG-1基因沉默對細胞周期的影響 （3）探討AEG-1基因沉默對凋亡的影響 （4）研究AEG-1基因沉默對腫瘤細胞侵襲的影響 （5）分析AEG-1基因沉默對細胞化療敏感性的影響 2.材料與

15、方法: （1）細胞增殖實驗：采用MTT法和克隆形成實驗評價AEG-1基因沉默對細胞增殖的影響。 （2）細胞周期分析：用流式細胞技術測定細胞DNA含量，Modtif軟件分析細胞周期。 （3）細胞凋亡實驗：采用Annexin-V和PI雙染流式細胞儀分析AEG-1基因沉默對細胞的凋亡情況的影響。 （4）細胞侵襲能力實驗：Transwell侵襲試驗。 （5）化療敏感性實驗：MTT法測定細胞對化療藥物敏感性的差異。

16、 3.結果: （1）AEG-1基因沉默細胞增殖分別降低45.1％，57.4％，明顯慢于親本細胞，克隆形成率分別降低43.5％，56.7％；非特異性對照轉(zhuǎn)染的細胞增殖未受明顯影響。 （2）AEG-1基因沉默細胞G0/G1期細胞增加29.3％，26.9％，與親本細胞相比有顯著性差異。 （3）AEG-1基因沉默細胞的凋亡率增加7.5％和6.4％。 （4）AEG-1基因沉默的細胞穿過膜的能力降低56.8％，50.0