用基于SNP分型的實(shí)時(shí)PCR定量檢測造血干細(xì)胞移植后的嵌合體.pdf

1、背景 造血干細(xì)胞移植是目前臨床上治療白血病、骨髓瘤、淋巴瘤、重型再生障礙性貧血和地中海貧血等血液系統(tǒng)疾病的最有效手段之一。根據(jù)造血干細(xì)胞的來源可以分為自體、異體同基因(如雙胞胎)、以及異基因(如父母、同胞或無血緣關(guān)系的供者)移植。隨著移植理論和技術(shù)的進(jìn)步，以及骨髓庫的完善，HLA相合或半相合的異基因造血干細(xì)胞移植在臨床上的應(yīng)用越來越廣泛。異基因干細(xì)胞移植的目的是建立供者型的正常造血與免疫功能，以取代受者原有的異常的造血及免疫系統(tǒng)

2、。為判斷移植是否成功并及時(shí)地實(shí)施免疫抑制治療、預(yù)后等，人們需要對移植后受體體內(nèi)形成的供、受者外周血細(xì)胞嵌合體進(jìn)行檢測并觀察其變化趨勢。此外，嵌合體分析還可為移植相關(guān)的其他免疫學(xué)研究提供良好的實(shí)驗(yàn)手段。 從遺傳學(xué)的角度來說，異基因的供受者外周血細(xì)胞嵌合體本質(zhì)上是兩個(gè)基因型不同的個(gè)體之細(xì)胞的混合物。因此，利用人體染色體上的一些遺傳標(biāo)記可以區(qū)分供受者細(xì)胞并對供受者細(xì)胞的比例進(jìn)行定量分析。傳統(tǒng)的嵌合體分析手段包括基于第一代和第二代遺傳標(biāo)

3、記檢測的RFLP-PCR和VNTR/STR-PCR技術(shù)，以及基于染色體片段分析的FISH技術(shù)，這些方法存在著一些局限性，如靈敏度低(如STR-PCR僅能達(dá)到5％-1％)，應(yīng)用面窄(如FISH僅能用于性別不合的供受者)等缺陷。近年來，隨著嵌合體分析在白血病復(fù)發(fā)及白血病微殘余灶監(jiān)測上的廣泛應(yīng)用，臨床實(shí)踐對嵌合體分析技術(shù)的檢測靈敏度和定量的精確性也提出了更高的要求。 SNP做為第三代遺傳標(biāo)記較RFLP、VNTR/STR有不可取代的優(yōu)勢

4、：①SNP在基因組中分布頻率更為廣泛，平均500～1000個(gè)堿基就有一個(gè)SNP，因而其整體的多態(tài)性高，易于選擇合適的有信息性高的SNP組；②SNP具有二等位性而易于對供受者分型，且能夠簡單快速的分析結(jié)果；③SNP分型手段多樣，如引物延伸法和等位基因特異性擴(kuò)增法等，這些方法特異性較高，而在VNTR-PCR和STR-PCR中，各等位基因因存在競爭性擴(kuò)增而引起終產(chǎn)物量較大的偏差，因此基于SNP分析的技術(shù)可以獲得更靈敏的檢測結(jié)果。 實(shí)時(shí)

5、熒光PCR是近年涌現(xiàn)出來的一項(xiàng)新技術(shù)，其優(yōu)點(diǎn)是：①對DNA模板的定量是通過實(shí)時(shí)地監(jiān)測PCR指數(shù)期的擴(kuò)增實(shí)現(xiàn)的，在精確性上明顯的優(yōu)于常規(guī)PCR技術(shù)所基于的終產(chǎn)物分析法；②實(shí)現(xiàn)了閉管分析和自動(dòng)化操作，其結(jié)果更加穩(wěn)定可靠；③對DNA模板檢測的動(dòng)力學(xué)范圍非常之廣，達(dá)到1～108的數(shù)量級范圍，因而具有異常高的靈敏度。 目的 為了提高嵌合體分析技術(shù)的靈敏度(如將靈敏度提高到至少0.1％)，精確性和穩(wěn)定性，同時(shí)兼顧技術(shù)操作的方便和相對

6、廉價(jià)，本研究試圖研發(fā)一種用于移植后嵌合體定量分析的新方法——基于SNP基因分型的實(shí)時(shí)熒光PCR定量技術(shù)。 方法 1.SNP位點(diǎn)的選擇 為適應(yīng)對中國人異基因造血干細(xì)胞移植后的嵌合體檢測，我們從dbSNP數(shù)據(jù)庫中搜索確定了7個(gè)SNP位點(diǎn)組成一個(gè)有信息性的SNP組，選擇的依據(jù)如下：(1)各SNP位點(diǎn)在中國人群中分布頻率介于0.2～0.8之間；(2)分布于不同的染色體上；(3)為兼顧SNP檢測的通用性，堿基替換盡可能涵蓋

7、多種類型。 2.基于SNP基因分型的定性方法的建立 本研究在方法學(xué)設(shè)計(jì)時(shí)，采用了等位基因特異性擴(kuò)增的原理，使用SybrGreenI嵌入式染料化學(xué)檢測法，建立了以實(shí)時(shí)PCR為技術(shù)平臺的SNP基因型分型方法，該體系共包括一對等位基因特異性引物及一條公共引物，分兩管擴(kuò)增同一份模板，每一管中加入其中一種等位基因特異性引物，根據(jù)實(shí)時(shí)PCR的擴(kuò)增曲線及解鏈曲線來判斷模板的基因型。該方法是用于每一對供受者對7個(gè)SNP位點(diǎn)的分型，為了實(shí)

8、現(xiàn)高通量，將7組PCR優(yōu)化在同一個(gè)條件下完成。 3.基于SNP基因分型的定量方法的建立 我們的定量檢測體系包括以下三個(gè)基本步驟： (1)硫代化反應(yīng)體系的建立：使用硫代修飾的AS-primer結(jié)合proofreadingDNA聚合酶對陰陽性標(biāo)本進(jìn)行擴(kuò)增。針對該體系產(chǎn)生假陽性擴(kuò)增的原因，我們設(shè)計(jì)了一種方法，將AS-primer與少量的oligotemplate(二者互補(bǔ)，僅在引物的3’末端錯(cuò)配)在Pfu存在下共孵育1

9、2h后加入PCR的其他成分并擴(kuò)增。 (2)有效上樣量的測定：由于提取的DNA質(zhì)量的差異，如純度、片斷的完整性和PCR抑制成分的含量等的不同，我們利用核酸蛋白分析儀測定的DNAOD260值與DNA中實(shí)際有效的，可擴(kuò)增的模板量并不相同，因此需要對每一份模板的有效上樣量進(jìn)行標(biāo)定。方法是設(shè)計(jì)一對引物用來擴(kuò)增一個(gè)非多態(tài)性的片段——β-珠蛋白基因片段。 (3)模擬嵌合體標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作：為準(zhǔn)確的測定嵌合體中體供/受者細(xì)胞的比例，需要通

10、過人工混合不同基因型的DNA模板來制作模擬嵌合體。其方法如下：通過SNP分型確定兩份模板(已測定有效上樣量)分別為某一SNP等位基因的陽性和陰性模板，然后用等濃度的陰性模板連續(xù)地稀釋陽性模板就能得到一梯度濃度的模擬嵌合體。采用十倍稀釋的方法，我們制成了100％、10％、1％、0.1％和0.01％的陽性/陰性混合模板，用實(shí)時(shí)PCR擴(kuò)增這些模板，根據(jù)CT值對陽性模板的濃度作圖便可得到模擬嵌合體的標(biāo)準(zhǔn)曲線。 4.病例標(biāo)本的分析

11、 每一例骨髓或外周血干細(xì)胞移植通常需要三份標(biāo)本，即供體標(biāo)本、移植前受體標(biāo)本和移植后受體標(biāo)本。移植前的供受體標(biāo)本用以進(jìn)行基因型分型，移植后受體標(biāo)本是用以測定供受者細(xì)胞的嵌合程度。臨床標(biāo)本分析的流程如下：首先用移植前供受者標(biāo)本對所選的7個(gè)SNP位點(diǎn)進(jìn)行分型，找出有信息的SNP位點(diǎn)，用嵌合體標(biāo)本擴(kuò)增β-珠蛋白基因片段，計(jì)算出該標(biāo)本的有效上樣量，然后用該標(biāo)本擴(kuò)增選定的SNP等位基因并由操作軟件導(dǎo)入標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算出該標(biāo)本中陽性模板的DNA量，最后

12、計(jì)算出供受體細(xì)胞的比例。 結(jié)果 1.SNP位點(diǎn)的選擇 從dbSNP數(shù)據(jù)庫中篩選了7個(gè)SNP位點(diǎn)，這7個(gè)SNP位點(diǎn)包括4種堿基替換類型，其中3個(gè)A/C，2個(gè)G/C，1個(gè)A/T和1個(gè)G/T，用本文所建立的SNP分型技術(shù)對這7個(gè)SNP位點(diǎn)分型，證明四種類型的替換均能取得較好的分型效果，然后對這7個(gè)SNP位點(diǎn)進(jìn)行在中國南方人群中的等位基因頻率篩查，發(fā)現(xiàn)所有的SNP的等位基因頻率均在0.2～0.8之間。 2.基于S

13、NP基因分型的定性方法的建立 首先用測序的方法篩選出了一個(gè)SNP位點(diǎn)三種基因型，以此為標(biāo)準(zhǔn)品建立了等位基因特異性擴(kuò)增的分型方法，通過對實(shí)時(shí)PCR的結(jié)果分析，各等位基因的解鏈曲線單一，并且雜合子的兩個(gè)等位基因的擴(kuò)增曲線重合，而純合子的擴(kuò)增曲線分離，這種分離符合實(shí)時(shí)PCR的動(dòng)力學(xué)特征，因此，可以用來判斷模板的基因型。 3.基于SNP基因分型的定量方法的建立 oligotemplate在不同的孵育時(shí)間下或在相同時(shí)間下用

14、不同的濃度與AS-primer共孵育后再進(jìn)行PCR，發(fā)現(xiàn)，隨時(shí)間的延長及oligotemplate量的增加，陰性模板的假陽性逐漸減少，而陽性模板的擴(kuò)增變化很小，證明了假陽性的來源是由于硫代引物的一種非對映異構(gòu)體被Pfu酶消化所引起的。由此我們建立了定量的方法。 4.樣本有效上樣量的測定 以基因組DNA為標(biāo)準(zhǔn)品通過倍比稀釋獲得四個(gè)梯度濃度，濃度范圍為1.56～100ng，用β-珠蛋白基因的引物擴(kuò)增后，操作軟件以測定的平均C

15、T值對濃度的對數(shù)值進(jìn)行線性回歸分析和擬合標(biāo)準(zhǔn)曲線并繪圖，最終獲得了標(biāo)準(zhǔn)曲線,該曲線擴(kuò)增效率高，線性關(guān)系好. 5.模擬嵌合體標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作 我們制作了rs37460C等位基因的標(biāo)準(zhǔn)曲線，陰、陽性模板經(jīng)重復(fù)分型并測定其有效上樣量，然后制作梯度濃度，梯度范圍在100～0.01％。經(jīng)實(shí)時(shí)PCR擴(kuò)增后，操作軟件輸出標(biāo)準(zhǔn)曲線：y=-3.827x+37.949，擴(kuò)增效率為0.83，R2=0.99785。 6.病例標(biāo)本的分析

16、 我們對4例β-地貧移植患者及其供體進(jìn)行分型，用rs37460的G和C等位基因特異性引物篩分這4對標(biāo)本，病例3的供受者是不同的純合子，因此rs37460位點(diǎn)為病例3的有信息性位點(diǎn)。 結(jié)論 初步建立了利用實(shí)時(shí)PCR技術(shù)通過對SNP的分型來分析嵌合體的方法，由于選擇了7個(gè)高雜合度的位點(diǎn)，該法能對至少95％的隨機(jī)供受者對進(jìn)行區(qū)分。采用等位基因特異性擴(kuò)增，該法能夠快速，準(zhǔn)確的對供受者分型。使用硫代化引物和高保真酶，消除了陰性