短干擾RNA抑制Hela細(xì)胞Ku80基因表達(dá)及其對(duì)放射敏感性的影響.pdf

1、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?構(gòu)建siRNA技術(shù)實(shí)驗(yàn)平臺(tái),觀察其對(duì)人宮頸癌Hela細(xì)胞DNA雙鏈損傷修復(fù)基因Ku80表達(dá)的抑制效果.初步探討Ku80基因表達(dá)受抑對(duì)Hela細(xì)胞放射敏感性和細(xì)胞周期的影響.材料和方法:1、siRNA線性DNA載體構(gòu)建:選擇人宮頸癌Hela細(xì)胞系內(nèi)源基因Ku80作為靶基因.先體外經(jīng)PCR構(gòu)建針對(duì)Ku80基因cDNA編碼區(qū)兩個(gè)不同位點(diǎn)以及無(wú)關(guān)位點(diǎn)的線性siRNA瞬時(shí)表達(dá)載體.2、用于轉(zhuǎn)染的Hela細(xì)胞分4組:空白對(duì)照組(只加脂質(zhì)體

2、)、無(wú)關(guān)對(duì)照(轉(zhuǎn)染Ku80無(wú)關(guān)的線性siRNA表達(dá)載體)、LS<,1>/LAS<,1>實(shí)驗(yàn)組和LS<,2>/LAS<,2>實(shí)驗(yàn)組(各自轉(zhuǎn)染針對(duì)Ku80基因cDNA不同位點(diǎn)的siRNA線性表達(dá)載體).載體經(jīng)脂質(zhì)體導(dǎo)入宮頸癌Hela細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生21bp長(zhǎng)度的短雙鏈siRNA.免疫印跡法分析不同時(shí)間點(diǎn)各組Hela細(xì)胞內(nèi)源性Ku80基因在蛋白水平表達(dá)的情況.3、各組細(xì)胞經(jīng)0、2、4、8、10Gy劑量射線處理.運(yùn)用克隆形成實(shí)驗(yàn)(clone as