RNA干擾SNCG基因表達(dá)對(duì)乳腺癌MCF-7細(xì)胞的放射敏感性的影響.pdf

1、背景
　　乳腺癌是女性最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，是美國(guó)婦女最常見(jiàn)并且第二大癌癥死亡的原因。在我國(guó)，乳腺癌的發(fā)病率和死亡率均呈明顯上升的趨勢(shì)，嚴(yán)重影響著婦女的身心健康甚至危及生命。乳腺癌傳統(tǒng)的治療方法包括手術(shù)、化療和放療。經(jīng)研究，40％-60％的乳腺癌患者需要接受放療。乳腺癌細(xì)胞對(duì)放射治療具有中度敏感性，然而患者的生存率并未得到明顯提高，并會(huì)出現(xiàn)復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移的可能。腫瘤的基因-放射治療是近年提出治療腫瘤的新思路，本研究中將基因治療與放射治

2、療有機(jī)結(jié)合，旨在研究基因治療對(duì)乳腺癌放射治療的增敏作用，并探討其機(jī)制。
　　SNCG(γ-synuclein)基因最早的研究發(fā)現(xiàn)于人類(lèi)乳腺癌cDNA文庫(kù)[1]，其在進(jìn)展期乳腺癌中呈現(xiàn)特異性表達(dá)，因此被稱(chēng)為乳腺癌特異性基因1(BCSG1)。SNCG基因位于染色體10q23，編碼一條包含123個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)[2]。研究表明，野生型SNCG基因在癌癥中的蛋白過(guò)表達(dá)可能與惡性程度相關(guān)[3]。SNCG的過(guò)度表達(dá)使其協(xié)助細(xì)胞躲避有絲分裂檢查

3、點(diǎn)，導(dǎo)致細(xì)胞產(chǎn)生非整倍體的增殖。SNCG基因序列研究發(fā)現(xiàn)，SNCG在腫瘤細(xì)胞系的過(guò)表達(dá)主要是因?yàn)檗D(zhuǎn)錄的被激活，而并非基因的擴(kuò)增或突變[4]。近年研究發(fā)現(xiàn)SNCG在乳腺癌[5]、子宮癌[6]、前列腺癌[7]、胰腺癌[8]、結(jié)直腸癌[9]等眾多惡性腫瘤中呈現(xiàn)高表達(dá)，其異常表達(dá)與腫瘤的分級(jí)和惡性進(jìn)展密切相關(guān)。SNCG過(guò)度表達(dá)會(huì)刺激乳腺癌細(xì)胞的增殖和誘導(dǎo)轉(zhuǎn)移[10]，可作為乳腺癌的獨(dú)立不良預(yù)后因素[11]，有望成為乳腺癌分子治療的靶點(diǎn)。

4、　　本實(shí)驗(yàn)通過(guò)脂質(zhì)體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染方法將shRNA導(dǎo)入乳腺癌MCF-7細(xì)胞中，下調(diào)SNCG基因的表達(dá)，并建立SNCG低表達(dá)的MCF-7穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株。將各組細(xì)胞聯(lián)合不同劑量的X線(xiàn)照射，觀(guān)察SNCG基因下調(diào)對(duì)乳腺癌細(xì)胞凋亡及放射敏感性的影響。
　　目的
　　研究RNA干擾對(duì)SNCG基因mRNA及蛋白水平的影響，以及SNCG-shRNA聯(lián)合不同劑量的X線(xiàn)照射對(duì)乳腺癌細(xì)胞凋亡及放射敏感性的影響，探討SNCG基因下調(diào)對(duì)乳腺癌細(xì)胞放療增敏

5、作用的可能機(jī)制。
　　材料與方法
　　1針對(duì)已知SNCG基因的cDNA序列，設(shè)計(jì)并合成4條特異性干擾序列(SNCG-shRNA-1、SNCG-shRNA-2、SNCG-shRNA-3、SNCG-shRNA-4)和1條非特異性序列(SNCG-shNC)。
　　2利用脂質(zhì)體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染技術(shù)將shRNA轉(zhuǎn)染至乳腺癌MCF-7細(xì)胞，通過(guò)半定量逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)及蛋白印跡技術(shù)(Westernblot)檢測(cè)SNCG

6、基因被干擾后在mRNA及蛋白水平的表達(dá)變化。
　　3通過(guò)克隆形成實(shí)驗(yàn)觀(guān)察SNCG-shRNA對(duì)乳腺癌細(xì)胞放射敏感性的影響。
　　4通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)SNCG-shRNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞聯(lián)合X線(xiàn)照射對(duì)細(xì)胞凋亡的影響。
　　5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法:采用SPSS17.0軟件分析。所有數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差((x)±s)表示，對(duì)定量資料進(jìn)行單因素方差分析，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)果
　　1脂質(zhì)體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染技術(shù)可將SNC

7、G-shRNA成功轉(zhuǎn)染至乳腺癌MCF-7細(xì)胞。
　　2RT-PCR和Westernblot結(jié)果顯示SNCG-shRNA轉(zhuǎn)染至乳腺癌MCF-7細(xì)胞后，SNCG基因在mRNA及蛋白水平的表達(dá)均明顯降低(P＜0.05)。
　　3克隆形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染陽(yáng)性組細(xì)胞的存活分?jǐn)?shù)明顯低于轉(zhuǎn)染陰性組和空白對(duì)照組，且差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。同時(shí)，各組細(xì)胞的存活分?jǐn)?shù)隨照射劑量的增加而呈現(xiàn)逐漸下降的趨勢(shì)。
　　4流式細(xì)胞術(shù)結(jié)