RNA干擾對結(jié)腸癌HT-29細胞PIDD蛋白表達及藥物敏感性影響的研究.pdf

1、一、背景與目的 在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中，核轉(zhuǎn)錄因子KB(NF-KB)的活化起著重要作用。已知NF-KB活化與腫瘤形成、血管生成、遠處轉(zhuǎn)移、抗凋亡等關(guān)系密切，而在腫瘤耐藥方面，目前的研究資料認為NF-KB活化后可上調(diào)腫瘤細胞存活基因的轉(zhuǎn)錄，使腫瘤細胞逃避化療藥物所引起的死亡效應(yīng)，從而誘導腫瘤耐藥。 在過去的研究中，已揭示了細胞表面受體誘導NF-kB活化的過程：在未受到刺激的細胞中，NF-kB與抑制蛋白結(jié)合在一起主要存在于細胞

2、漿中。受到某些因子的刺激后，細胞漿內(nèi)的一系列激酶活化從而引起NF-kB的活化，隨即，活化的NF-kB進入細胞核，激活目的基因的轉(zhuǎn)錄。但最近的研究資料表明，NF-kB活化的“胞核至胞漿(nuclear-to-plasmic)”通路也許更為重要，因為大多數(shù)化療藥物可直接引起DNA損傷，其誘導NF-kB活化的始動因素正是居于細胞核內(nèi)。PIDD(p53-induced protein with a deathdomain)在細胞DNA損傷中介導

3、了NF-KB“胞核至胞漿”通路的活化過程。它是最近發(fā)現(xiàn)的一個蛋白分子，主要存在于胞漿內(nèi)，分子量約100kDa，在胞漿中分裂成為含死亡結(jié)構(gòu)域的C末端PIDD-C和富含亮氨酸重復(fù)序列的N末端PIDD-N。目前的研究發(fā)現(xiàn)PIDD-C可進入胞核內(nèi)與NEMO(NF-KB essential modulator)和RIP1(receptor-interactingprotein1)形成“胞核PIDD復(fù)合體”，在基因毒性應(yīng)激(genotoxic st

4、ress)條件下，SUMO( small ubiquitin-like modifier)與復(fù)合物中的NEMO(NF-kB essential modulator)結(jié)合，促進其發(fā)生磷酸化和泛素化，活化后的NEMO從胞核進入胞漿，降解IkB， NF-kB即被活化進入胞核，啟動存活基因的轉(zhuǎn)錄，從而表現(xiàn)為抗凋亡效應(yīng)。 鑒于PIDD在細胞抗凋亡的過程中起著重要作用，而既往有關(guān)研究資料又缺乏對PIDD與結(jié)腸癌細胞藥物敏感性關(guān)系的探討，本研

5、究重點討論PIDD所介導的抗凋亡途徑與HT-29細胞藥物敏感性變化的關(guān)系，初步明確PIDD對于結(jié)腸癌細胞藥物敏感性的作用，以進一步完善結(jié)腸癌細胞耐藥性的發(fā)生機制。 二、方法 1.PIDD siRNA的構(gòu)建、轉(zhuǎn)染及檢測根據(jù)人PIDD的mRNA，應(yīng)用RNAi設(shè)計軟件，進行全基因組掃描和序列同源性分析，設(shè)計針對Genbank中PIDD的特異siRNA四對，同時設(shè)計一套序列相同的陰性對照。將siRNA分別轉(zhuǎn)染HT-29細胞，轉(zhuǎn)染

6、24h、48h、72h用熒光顯微鏡檢測轉(zhuǎn)染效率。提取細胞蛋白，并用Western blot法檢測轉(zhuǎn)染效果。選擇轉(zhuǎn)染效果最佳的siRNA作為轉(zhuǎn)染組，進行后繼實驗。 2.分別用5-Fu處理空白對照組、陰性對照組及轉(zhuǎn)染組的細胞，抽提處理前后共6組細胞的胞漿及胞核蛋白，Westem blotting檢測PIDD表達。3組細胞處理前后NF-kB活性及凋亡率的變化分別由凝膠阻滯分析實驗(electrophoretic mobility sh

7、ift assay，EMSA)及流式細胞儀(FCM)檢測。MTT法檢測3組細胞對5-Fu的敏感性。 三、主要結(jié)果 1.PIDD siRNA的轉(zhuǎn)染效率熒光顯微鏡觀察，各組轉(zhuǎn)染細胞組在各時相點的轉(zhuǎn)染率均大于90％，Westem blotting檢測，可以發(fā)現(xiàn)與其它3種siRNA相比較，PIDD-360的轉(zhuǎn)染效率有升高的趨勢，但差異無統(tǒng)計學意義。同時這種抑制效應(yīng)存在一定的時效關(guān)系，即：轉(zhuǎn)染48h后能檢測出抑制效應(yīng)，72-96h

8、左右達到最高峰。 2.Westem blotting結(jié)果提示轉(zhuǎn)染組的細胞核和細胞質(zhì)中，PIDD的表達均明顯低于對照組；在空白組對照組和陰性對照組細胞中PIDD主要分布于細胞質(zhì)，細胞核少見表達。空白對照和對陰性照給予5-Fu處理后PIDD分布發(fā)生了明顯的變化，遷移至細胞核中；轉(zhuǎn)染組5-Fu處理后PIDD在胞漿和胞核中的表達仍未升高。 3.MTT結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染組的藥物敏感性明顯降低，與空白對照組及陰性對照組相比有統(tǒng)計學意義(P

9、<0.05)。 4.EMSA檢測細胞核蛋白NF-kB的活性未用5-Fu處理的3組HT-29細胞NF-KB的表達均為陰性，在用5-Fu刺激后，空白對照組及陰性對照組NF-1(B的活性明顯增高，而轉(zhuǎn)染組則仍為陰性。 5.FCM分析三組細胞的凋亡率接近，無統(tǒng)計學差異(P>0.05)，但給予5-Fu處理后，則轉(zhuǎn)染組的凋亡率大大高于其他兩組，差異顯著(P<0.05)。 四、結(jié)論 1.特異性siRNA可減低HT-29