RNA干擾HIF-1α對食管癌放射敏感性影響的實驗研究.pdf

1、目的：
　　 研究食管鱗狀細(xì)胞癌及正常食管組織中HIF-1α和VEGF的表達(dá)情況，兩者表達(dá)的相關(guān)性及其與臨床病理特征和放療反應(yīng)之間的關(guān)系；檢測RNA干擾HIF-1α后HIF-1α和VEGF的變化、及其對細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期的影響；通過體外和體內(nèi)實驗檢查KYSE-150細(xì)胞在RNA干擾后放射敏感性的變化，初步探討其影響放射敏感性的機(jī)制，為食管癌放射增敏及基因治療提供新的靶點。
　　 方法：
　　 選取42例接受手術(shù)的

2、食管鱗狀細(xì)胞癌新鮮標(biāo)本，通過實時定量PCR、免疫組化檢查癌組織和正常組織中的HIF-1α及VEGF的表達(dá)情況，分析其相關(guān)性及與臨床病理特征的聯(lián)系；另選接受單純放療的食管癌標(biāo)本60例，免疫組化檢測HIF-1僅及VEGF的表達(dá)，分析其與放射反應(yīng)及預(yù)后的關(guān)系。針對HIF-1α基因的mRNA序列設(shè)計三個siRNA序列構(gòu)建質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染KYSE-150食管癌細(xì)胞系，潮霉素篩選獲得穩(wěn)定表達(dá)siRNA的細(xì)胞克隆，實時定量PCR、Western-blot方

3、法檢測細(xì)胞中HIF-1αmRNA及蛋白表達(dá)，驗證干擾效果并篩選能夠成功沉默HIF-1α的序列；實時定量PCR、Western-blot方法檢測RNA干擾后VEGF的變化，MTT法、流式細(xì)胞儀檢測siRNA對細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期的影響；體外使用不同劑量的X線分別照射KYSE-150細(xì)胞和穩(wěn)定表達(dá)siRNA的細(xì)胞克隆，平板克隆形成實驗及MTT法檢測放射線照射后的細(xì)胞存活情況。采用KYSE-150食管癌細(xì)胞及KYSE-150/HIF-1α（-）

4、細(xì)胞建立裸鼠食管癌移植瘤模型，分組后進(jìn)行不同劑量的放射線照射，建立生長曲線，對比研究兩組腫瘤照射后的放療反應(yīng)，根據(jù)生長延緩和照射劑量分析其放射敏感性差異；對兩種腫瘤標(biāo)本進(jìn)行HE及免疫組化染色，比較其HIF-1α、Ki67及CD34表達(dá)差異。
　　 結(jié)果：
　　 HIF-1α和VEGF在食管鱗狀細(xì)胞癌中的表達(dá)率分別為50.0％和76.2％，而在正常食管黏膜組織中表達(dá)率為14.3％和33.3％，二者在食管癌中的表達(dá)存在強(qiáng)相關(guān)

5、性，而在正常食管黏膜組織中弱相關(guān)。免疫組化顯示食管鱗狀細(xì)胞癌中HIF-1α蛋白在胞漿與胞核中均有陽性表達(dá)，但胞核較胞漿表達(dá)強(qiáng)：食管正常粘膜細(xì)胞中HIF-1α蛋白表達(dá)不穩(wěn)定且表達(dá)較弱。食管鱗狀細(xì)胞癌中HIF-1α蛋白表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及腫瘤組織分化相關(guān)，VEGF表達(dá)與臨床病理特征無關(guān)，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及腫瘤組織分化差者較無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及腫瘤組織分化好HIF-1α蛋白表達(dá)率高。HIF-1α和VEGF在接受單純放療的食管癌中的表達(dá)與放療敏感性及預(yù)后有

6、關(guān)，陰性表達(dá)較陽性表達(dá)放療敏感性高，預(yù)后較好。成功構(gòu)建了三個HIF-1α的靶向siRNA，并與pGCsi-H1/Hygro/GFP質(zhì)粒連接，通過電轉(zhuǎn)染食管癌KYSE-150細(xì)胞，經(jīng)篩選后得到穩(wěn)定的干擾后細(xì)胞，實時定量PCR、Western-blot結(jié)果證實shRNA3能夠使HIF-1α表達(dá)沉默，并能抑制VEGF表達(dá)，MTT法示轉(zhuǎn)染shRNA3組細(xì)胞在缺氧條件下增殖活力減弱，流式細(xì)胞儀檢測示細(xì)胞周期中G0/G1期比例降低，而凋亡增加；平板

7、克隆形成實驗及MTT法示shRNA3組細(xì)胞照射后存活分?jǐn)?shù)降低，計算結(jié)果放射敏感性提高。接種KYSE-150/HIF-1α（-）細(xì)胞的裸鼠皮下移植瘤生長明顯慢于接種KYSE-150細(xì)胞組，兩組移植瘤的免疫組化染色顯示，接種KYSE-150/HIF-1α（-）細(xì)胞的腫瘤中HIF-1α、Ki67和CD34的表達(dá)均明顯低于KYSE-150組。X線照射可以使兩組移植瘤均出現(xiàn)生長緩慢甚至體積減小，KYSE-150/HIF-1α（-）組放射照射后生長

8、延緩更加明顯，計算結(jié)果SER大于1。
　　 結(jié)論：
　　 HIF-1α和VEGF在食管鱗狀細(xì)胞癌中均呈高表達(dá)，且二者的表達(dá)呈強(qiáng)相關(guān)性。食管鱗狀細(xì)胞癌中HIF-1α蛋白在胞漿與胞核中均有陽性表達(dá)，胞核較胞漿表達(dá)更強(qiáng)，更特異。食管鱗狀細(xì)胞癌中HIF-1α表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及腫瘤組織分化有關(guān)，HIF-1α高表達(dá)時淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率更高，腫瘤組織分化更差。在單純接受放療的食管癌中HIF-1α和VEGF的表達(dá)與放療敏感性及預(yù)后有關(guān)，陰性表