siRNA沉默TPX2對(duì)人宮頸癌HeLa細(xì)胞放射敏感性的影響.pdf

1、目的：對(duì)于分期較晚不考慮外科治療的宮頸癌患者，主要的治療手段之一是放療。腫瘤細(xì)胞對(duì)射線殺傷是否敏感直接決定了療效和疾病預(yù)后。DNA修復(fù)蛋白與腫瘤的放射敏感性關(guān)系密切。TPX2主要在胞核中起作用，依賴(lài)細(xì)胞周期并受其調(diào)節(jié)，與有絲分裂中紡錘體的準(zhǔn)確合成及結(jié)構(gòu)穩(wěn)定有直接關(guān)系。TPX2基因異常表達(dá)直接產(chǎn)生的結(jié)果是中心體出現(xiàn)反常擴(kuò)增及異倍體形成，同時(shí)與腫瘤轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)明顯相關(guān)。已有研究證實(shí)了射線依賴(lài)的H2AX形成量與DNA雙鏈斷裂點(diǎn)的數(shù)量之間有相關(guān)關(guān)

2、系。最新的研究發(fā)現(xiàn)胞內(nèi)TPX2蛋白發(fā)生不同程度的消耗時(shí)，射線誘導(dǎo)的H2AX的數(shù)量會(huì)呈現(xiàn)短暫增加的現(xiàn)象。本實(shí)驗(yàn)主要利用RNAi技術(shù)，設(shè)計(jì)合成靶基因TPX2的小干擾 RNA，觀察導(dǎo)入siRNA后HeLa細(xì)胞中TPX2 mRNA和蛋白表達(dá)的改變，以及HeLa細(xì)胞放射敏感性的變化，為宮頸癌的放射增敏提供了研究方向。
　　方法：選擇人宮頸癌 HeLa細(xì)胞，根據(jù)小干擾 RNA設(shè)計(jì)原則設(shè)計(jì)靶基因 TPX2的siRNA，共設(shè)計(jì)3對(duì)分別為siRNA

3、-1、siRNA-2和siRNA-3，同時(shí)設(shè)計(jì)陰性對(duì)照siRNA。利用 riboFECTTMCP轉(zhuǎn)染試劑，將siRNA轉(zhuǎn)染入HeLa細(xì)胞，對(duì)轉(zhuǎn)染后各組細(xì)胞內(nèi)TPX2 mRNA和蛋白質(zhì)的表達(dá)情況進(jìn)行觀察。主要采用RT-PCR、 Western Blotting法，于轉(zhuǎn)染后48 h進(jìn)行，提取總RNA和總蛋白后檢測(cè)TPX2 mRNA和蛋白表達(dá)情況，并篩選出最佳轉(zhuǎn)染組及最佳轉(zhuǎn)染時(shí)間。實(shí)驗(yàn)分組：目的基因組、陰性對(duì)照組、空白對(duì)照組。利用riboFE

4、CTTMCP將siRNA轉(zhuǎn)染入宮頸癌HeLa細(xì)胞中進(jìn)行4 Gy-X線照射，利用CCK8法和流式細(xì)胞術(shù)觀察TPX2表達(dá)下調(diào)的HeLa細(xì)胞對(duì)射線的敏感性的改變。
　　結(jié)果：轉(zhuǎn)染48 h后提取總RNA，利用RT-PCR觀察轉(zhuǎn)染后各組細(xì)胞TPX2 mRNA的相對(duì)表達(dá)量發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染針對(duì)靶基因TPX2的siRNA的各組細(xì)胞均表現(xiàn)出TPX2基因表達(dá)抑制效應(yīng)，以siRNA-2效果最明顯，其TPX2的相對(duì)含量為（0.133±0.008）與空白對(duì)照組（

5、1.000）及陰性對(duì)照組（0.981±0.814）相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。轉(zhuǎn)染后繼續(xù)培養(yǎng)48 h，用Western Blot法檢測(cè)HeLa細(xì)胞TPX2蛋白的表達(dá)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)siRNA-2組TPX2蛋白表達(dá)明顯降低，蛋白相對(duì)含量為（0.518±0.685），空白對(duì)照組為（1.064±0.794），陰性對(duì)照組為（0.981±0.814），siRNA-2組與陰性對(duì)照組及空白對(duì)照組比較，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。HeLa細(xì)胞放射敏感

6、性的檢測(cè)：轉(zhuǎn)染后給予4 Gy X線照射，①利用CCK8檢測(cè)各組細(xì)胞OD值，并計(jì)算細(xì)胞增殖活力，沉默 TPX2組為（0.147±0.003），陰性對(duì)照組為（0.224±0.009），空白對(duì)照組為（0.353±0.012），統(tǒng)計(jì)學(xué)分析得出F=9.243，P=0.0015，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；②用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡率發(fā)現(xiàn)各組細(xì)胞均出現(xiàn)凋亡增加，其中沉默TPX2組細(xì)胞凋亡率為（12.68±0.03%），陰性對(duì)照組為（9.3