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文檔簡(jiǎn)介
1、血管平滑肌細(xì)胞(vascular smooth muscle cells,VSMC)的增殖和分化受一系列調(diào)節(jié)因子構(gòu)成的信號(hào)網(wǎng)絡(luò)所調(diào)控。其中轉(zhuǎn)錄因子Krüppel樣因子5(krüppel-like factor5,KLF5)通過(guò)調(diào)節(jié)增殖/分化基因的表達(dá)活性而影響細(xì)胞的增殖活性。有研究顯示,人工合成的維甲酸衍生物Am80通過(guò)激活其受體RARα而抑制KLF5與RARα相互作用和KLF5的活化,進(jìn)而解除KLF5對(duì)p21基因表達(dá)的抑制。然而,Am
2、80是通過(guò)何種機(jī)制抑制KLF5活性尚不清楚。乙?;揎椩贙LF5活性調(diào)節(jié)中具有重要意義,但對(duì)其在VSMC分化中的作用研究較少。本研究以組蛋白脫乙酰酶(histonedeacetylases,HDACs)為切入點(diǎn),以p21為靶基因,探討KLF5乙?;礁淖兣c其轉(zhuǎn)錄激活活性的關(guān)系,并揭示其作用機(jī)制。
方法與結(jié)果:
1 Am80抑制VSMC細(xì)胞周期的進(jìn)程
用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期分布,結(jié)果顯示,與對(duì)
3、照組相比Am80刺激VSMC24h后,G0/G1期細(xì)胞所占比例上升了13%,S期細(xì)胞比例下降了29%。兩組之間具有顯著性差異。說(shuō)明Am80可誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯。
2 Am80抑制VSMC增殖
MTT分析結(jié)果顯示,Am80刺激細(xì)胞12、24、48 h,VSMC增殖活性顯著被抑制。與對(duì)照組相比,細(xì)胞增殖活性分別降低了44%、35%、26%,該結(jié)果與細(xì)胞周期分析數(shù)據(jù)具有一致性。
3 Am80誘導(dǎo)p21蛋
4、白的表達(dá)
為了探討Am80誘導(dǎo)細(xì)胞阻滯的作用機(jī)制,我們選用不同濃度Am80刺激細(xì)胞24h,提取總蛋白,觀察細(xì)胞周期抑制蛋白p21表達(dá)的變化,Western blot結(jié)果顯示,在Am80濃度為0-5μM范圍內(nèi),隨著Am80濃度增加,p21的表達(dá)水平呈劑量依賴性的升高,提示Am80可上調(diào)p21蛋白表達(dá)。4 Am80顯著抑制球囊損傷誘導(dǎo)的血管內(nèi)膜增生
與假手術(shù)組相比,球囊內(nèi)皮剝脫后14天的模型組頸總動(dòng)脈中膜內(nèi)的VS
5、MC排列紊亂,內(nèi)膜呈彌散性增厚,管腔變小,內(nèi)膜與中膜的厚度比值(I/M)(2.10±0.26)明顯高于假手術(shù)組(0.18±0.08);Am80組新生內(nèi)膜的增生程度和I/M比值(0.3±0.11)明顯小于模型組(P<0.05,n=3)。結(jié)果表明,Am80可以明顯抑制球囊損傷誘導(dǎo)的血管內(nèi)膜增生。
5 Am80通過(guò)抑制KLF5乙?;险{(diào)p21表達(dá)
為探討Am80抑制p21表達(dá)的分子機(jī)制以及KLF5乙?;阶兓欠?/p>
6、在該過(guò)程中發(fā)揮作用,進(jìn)行觀察了Am80對(duì)KLF5乙?;挠绊?。用不同濃度Am80(0、1、2、5和10μM)處理VSMC2h,提取細(xì)胞總蛋白,經(jīng)抗KLF5抗體免疫沉淀后,用抗賴氨酸抗體進(jìn)行Western印跡分析,以檢測(cè)KLF5的乙?;健=Y(jié)果顯示,隨著Am80濃度的增加,KLF5乙?;街饾u降低,具有明顯的劑量依賴關(guān)系。
整體動(dòng)物實(shí)驗(yàn)也證明,與模型組相比,給予Am80的大鼠血管組織中,KLF5乙酰化水平降低。在術(shù)后3d
7、和14d時(shí),Am80組血管乙?;疜LF5水平分別較模型組下降了17%和34%。上述結(jié)果在整體水平及細(xì)胞水平證實(shí),Am80能抑制KLF5的乙?;?。
6 Am80誘導(dǎo)KLF5與HDAC2相互作用
HDAC2是調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)乙酰化修飾的關(guān)鍵酶。為確定HDAC2是否參與Am80誘導(dǎo)的KLF5脫乙?;^(guò)程,本研究觀察了KLF5與HDAC2的相互作用。免疫共沉淀分析結(jié)果顯示,在Am80刺激前后的VSMC中,KLF5均可與
8、HDAC2共沉淀;但是Am80刺激后,KLF5和HDAC2相互作用程度呈劑量依賴性增強(qiáng),說(shuō)明Am80能顯著促進(jìn)二者結(jié)合。免疫雙熒光共定位分析結(jié)果進(jìn)一步證實(shí),在VSMC中KLF5與HDAC2共定位,疊加后的熒光強(qiáng)度隨著Am80刺激而增強(qiáng)。給予RARα受體抑制劑Ro41-5253預(yù)處理VSMC,可消除Am80誘導(dǎo)的KLF5與HDAC2相互作用。上述結(jié)果表明Am80誘導(dǎo)KLF5脫乙?;c促進(jìn)KLF5與HDAC2的相互作用有關(guān)。
9、7乙?;腒LF5促進(jìn)p21啟動(dòng)子活性
為了確定KLF5是否參與調(diào)節(jié)p21啟動(dòng)子活性以及與HDAC2相互作用對(duì)其轉(zhuǎn)錄激活作用的影響,分別將p21啟動(dòng)子指導(dǎo)的報(bào)告基因質(zhì)粒(p21-luc)與KLF5和/或HDAC2表達(dá)質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293A細(xì)胞,通過(guò)雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)系統(tǒng)定量分析啟動(dòng)子的活性。結(jié)果顯示,293A細(xì)胞共轉(zhuǎn)染HDAC2和KLF5后,所測(cè)得熒光素酶的活性比單獨(dú)轉(zhuǎn)染KLF5升高了3倍。提示,KLF5與HDAC2對(duì)p2
10、1基因啟動(dòng)子的激活具有協(xié)同效應(yīng)。為了確定該協(xié)同效應(yīng)是否與KLF5的乙?;嘘P(guān),進(jìn)而構(gòu)建KLF5乙酰化位點(diǎn)突變(K369R)的表達(dá)質(zhì)粒,并分別將其與乙?;竝300表達(dá)質(zhì)粒和p21-luc共轉(zhuǎn)染293A細(xì)胞,觀察對(duì)報(bào)告基因活性的影響。結(jié)果顯示,p300和KLF5表達(dá)質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染細(xì)胞時(shí),可協(xié)同抑制報(bào)告基因的表達(dá)活性。當(dāng)KLF5突變體與P300表達(dá)質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染時(shí),對(duì)p21啟動(dòng)子的協(xié)同抑制作用消失。上述結(jié)果表明:KLF5的乙?;种苝21的表達(dá);K
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