緩激肽對TNF-α誘導的NIT-1細胞凋亡的影響及其機制.pdf

1、研究背景：激肽釋放酶-激肽系統(tǒng)是體內的一個重要調節(jié)系統(tǒng)。激肽釋放酶-激肽系統(tǒng)包括激肽釋放酶、激肽原、激肽、激肽BK1、BK2受體和激肽酶等幾種組分。激肽釋放酶是一類絲氨酸蛋白酶，可催化低分子量的激肽原釋放出有血管活性的激肽。緩激肽是生理條件下主要的激肽類物質。緩激肽與其BK2受體結合后能激活多種信號途徑，從而發(fā)揮多種生物學效應，包括擴張血管，平滑肌的收縮和舒張，細胞增殖，炎癥和疼痛。糖尿病有1型和2型兩種，它們都表現(xiàn)為進行性的β細胞功能

2、衰竭。在1型糖尿病中，以β細胞的自身免疫為典型表現(xiàn)，從而誘導β細胞的進行性死亡。2型糖尿病則伴有不同程度的β細胞缺乏以及不同程度的胰島素抵抗。Β細胞的凋亡因此是1型糖尿病和2型糖尿病的一個共同特征。一些研究表明，緩激肽可以通過激活BK2受體使鈣離子內流從而促進β細胞分泌胰島素，此外，人組織激肽釋放酶也可以改善果糖誘導的高血壓伴胰島素抵抗大鼠的高胰島素血癥。這些都提示了激肽釋放酶系統(tǒng)在糖尿病中發(fā)揮了重要的保護性作用。但是，激肽釋放酶系統(tǒng)在

3、細胞水平是否具有抗凋亡作用還不清楚。在本實驗中，我們探尋了緩激肽對TNF-α誘導的NIT-1細胞凋亡的作用及其可能的相關機制。
　　 方法：在培養(yǎng)的NIT-1細胞中，給予外源性緩激肽作用2小時，在需要的試驗組中，在緩激肽干預之前加入緩激肽BK2特異性受體阻滯劑HOE140預處理30分鐘，然后再應用TNF-α(100ng/ml)誘導NIT-1細胞凋亡24小時。分別用SRB法和Annexin V/PI雙染流式細胞儀檢測凋亡情況。用w

4、estern blotting檢測各組細胞中Bcl-2、Bcl-xl、Bax和PI3K的表達水平以及Akt和MAPK的磷酸化水平。
　　 結果：試驗均重復三次：TNF-α能夠誘導NIT-1細胞的凋亡，外源性的緩激肽可以抑制TNF-α誘導的NIT-1細胞的凋亡，HOE140可以阻斷緩激肽的效應。Annexin V/PI雙染流式細胞儀檢測NIT-1細胞凋亡發(fā)現(xiàn)，TNF-α組細胞凋亡比例明顯高于對照組，BK組細胞凋亡比例明顯低于TNF

5、-α組，BK+HOE140組細胞凋亡比例與BK組相比則明顯增高。Western blotting檢測發(fā)現(xiàn)，TNF-α組Bcl-2，Bcl-xl和PI3K的表達水平以及Akt和MAPK的磷酸化水平較之對照組明顯降低，相反，Bax的表達水平相對于對照組明顯增高；而BK組中Bcl-2，Bcl-xl和PI3K的表達水平以及Akt和MAPK的磷酸化水平較之TNF-α組明顯增高，Bax的表達水平則明顯降低；BK+HOE140組與BK組相比可阻斷緩激

6、肽這一效應，而與TNF-α組無明顯差異。
　　 結論：我們的研究結果顯示，外源性緩激肽能夠抑制TNF-α誘導的小鼠胰島素瘤細胞NIT-1的凋亡，其可能的機制是緩激肽與BK2受體結合，通過激活細胞內的PI3K-Akt通路和MAPK通路，并通過上調Bcl-2，Bcl-xl的表達水平和下調Bax的表達水平來發(fā)揮其抗凋亡作用。但是，緩激肽是通過多條信號通路發(fā)揮生物學作用的，與細胞內的凋亡信號通路之間存在著復雜的交叉通話，其機制還有待進一