帶神經(jīng)干細(xì)胞的周圍神經(jīng)移植聯(lián)合氯化鋰治療大鼠脊髓損傷的研究.pdf

1、第一部分:綠色熒光蛋白轉(zhuǎn)基因大鼠胚胎脊髓來源神經(jīng)干細(xì)胞的分離、培養(yǎng)和鑒定
　　目的:大鼠胚胎脊髓來源的神經(jīng)干細(xì)胞(Neural stem cell,NSC)的體外培養(yǎng)和鑒定。
　　方法:采用酶消化和機(jī)械分離法結(jié)合從孕13.5天的攜帶綠色熒光蛋白(Green fluorescent protein,GFP)的轉(zhuǎn)基因大鼠胚胎脊髓中分離、培養(yǎng)神經(jīng)干細(xì)胞,采用免疫熒光染色方法檢測培養(yǎng)細(xì)胞的巢蛋白(Nestin)、溴脫氧尿苷(Brom

2、odeoxyuridine,BrdU)、神經(jīng)元核蛋白(Neuronal nuclei,NeuN)和膠質(zhì)纖維酸性蛋白(Glial fibrillary acidic protein,GFAP)的表達(dá)情況,對培養(yǎng)細(xì)胞進(jìn)行鑒定。
　　結(jié)果:GFP轉(zhuǎn)基因大鼠胚胎脊髓來源的神經(jīng)干細(xì)胞在體外培養(yǎng)環(huán)境下生長良好,表達(dá)GFP和特異性蛋白Nestin,BrdU染色陽性,在添加血清后能表達(dá)NeuN和GFAP蛋白。
　　結(jié)論:從GFP轉(zhuǎn)基因大鼠胚

3、胎脊髓中分離培養(yǎng)的細(xì)胞能表達(dá)神經(jīng)干細(xì)胞特異性蛋白,具有自我更新能力和一定條件下的多向分化能力,證實(shí)是神經(jīng)干細(xì)胞。
　　第二部分:氯化鋰對體外培養(yǎng)的神經(jīng)干細(xì)胞的影響
　　目的:研究氯化鋰對體外培養(yǎng)的神經(jīng)干細(xì)胞的增殖和分化的影響。
　　方法:在神經(jīng)干細(xì)胞培養(yǎng)液內(nèi)添加氯化鋰,觀察不同濃度的氯化鋰對神經(jīng)干細(xì)胞生長狀態(tài)的影響;用免疫熒光方法檢測神經(jīng)干細(xì)胞BrdU、NeuN、GFAP的表達(dá)情況。
　　結(jié)果:添加1mM氯化鋰的

4、神經(jīng)干細(xì)胞的生長良好,3mM的氯化鋰會抑制神經(jīng)干細(xì)胞的生長,6mM的氯化鋰會造成神經(jīng)干細(xì)胞死亡。在保留或去除表皮生長因子(Epidermal Growth Factor,EGF)和堿性成纖維細(xì)胞生長因子(Fibroblast growth factor-basic,bFGF)的情況下,1mM的氯化鋰均能明顯增加神經(jīng)干細(xì)胞的BrdU表達(dá);與對照組比較,氯化鋰處理組神經(jīng)干細(xì)胞的NeuN陽性神經(jīng)元比例明顯增加,GFAP陽性膠質(zhì)細(xì)胞的比例明顯減

5、少。
　　結(jié)論:1mM濃度的氯化鋰對神經(jīng)干細(xì)胞的生長沒有毒性作用,能促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞的增殖,促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞向神經(jīng)元方向分化,抑制神經(jīng)干細(xì)胞向膠質(zhì)細(xì)胞方向分化。
　　第三部分:氯化鋰對移植到周圍神經(jīng)內(nèi)神經(jīng)干細(xì)胞的影響
　　目的:研究氯化鋰對移植到脛神經(jīng)內(nèi)的神經(jīng)干細(xì)胞的存活、分化的影響;研究神經(jīng)干細(xì)胞移植和氯化鋰處理對宿主神經(jīng)軸突潰變、炎癥細(xì)胞浸潤及神經(jīng)營養(yǎng)因子表達(dá)的影響。
　　方法:結(jié)扎成年大鼠右側(cè)脛神經(jīng),將培養(yǎng)的神

6、經(jīng)干細(xì)胞移植到脛神經(jīng)遠(yuǎn)端,腹腔注射氯化鋰或生理鹽水,一周后用免疫熒光染色方法檢測神經(jīng)干細(xì)胞的Nestin、NeuN、膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶(Cholin acetyltransferase,ChAT)、GFAP、神經(jīng)纖絲蛋白200(Neurofilament 200kDa,NF200)、巨噬細(xì)胞抗原(ED1)的表達(dá)情況;用免疫印跡法(Western bloting,WB)檢測坐骨神經(jīng)內(nèi)腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(Brain derived neurot

7、rophic factor,BDNF)的表達(dá)。
　　結(jié)果:移植到脛神經(jīng)內(nèi)的神經(jīng)干細(xì)胞存活良好,并沿神經(jīng)軸索間隙向周圍擴(kuò)散。移植后的神經(jīng)干細(xì)胞未見明顯Nestin陽性表達(dá),大部分移植細(xì)胞呈GFAP陽性表達(dá),無明顯NeuN或ChAT陽性表達(dá)。腹腔注射氯化鋰能顯著減少移植細(xì)胞的GFAP陽性表達(dá)比例。脛神經(jīng)結(jié)扎后,神經(jīng)內(nèi)軸突潰變明顯。與未移植NSC的兩組比較,NSC移植組脛神經(jīng)內(nèi)NF200陽性表達(dá)明顯增多,聯(lián)合應(yīng)用氯化鋰能進(jìn)一步增加NF2

8、00的表達(dá)。應(yīng)用氯化鋰顯著減少NSC移植后脛神經(jīng)內(nèi)的ED1表達(dá)。單純神經(jīng)干細(xì)胞移植組和單純氯化鋰組的宿主坐骨神經(jīng)的BDNF表達(dá)明顯上調(diào),兩者聯(lián)用時(shí)BDNF表達(dá)上調(diào)更明顯。
　　結(jié)論:脛神經(jīng)內(nèi)移植的神經(jīng)干細(xì)胞存活良好,大部分分化為GFAP陽性的膠質(zhì)細(xì)胞;氯化鋰處理能減少移植后的神經(jīng)干細(xì)胞向膠質(zhì)細(xì)胞方向的分化,神經(jīng)干細(xì)胞移植聯(lián)合應(yīng)用氯化鋰可以減少宿主神經(jīng)軸突的潰變程度,抑制神經(jīng)干細(xì)胞移植后的巨噬細(xì)胞浸潤;上調(diào)宿主脛神經(jīng)內(nèi)BDNF的表達(dá)

9、。
　　第四部分:含神經(jīng)干細(xì)胞的脛神經(jīng)移植聯(lián)合氯化鋰治療大鼠脊髓損傷的研究
　　目的:研究含有神經(jīng)干細(xì)胞的脛神經(jīng)移植聯(lián)合氯化鋰對脊髓損傷的治療作用。
　　方法:在大鼠脛神經(jīng)內(nèi)移植神經(jīng)干細(xì)胞一周后,建立胸段脊髓右側(cè)半切損傷模型,將單純脛神經(jīng)或預(yù)先移植有神經(jīng)干細(xì)胞的脛神經(jīng)段植入脊髓缺損區(qū),腹腔注射氯化鋰或生理鹽水,術(shù)后2周、4周分別測定大鼠下肢運(yùn)動(dòng)功能恢復(fù)情況。術(shù)后4周用免疫熒光染色方法檢測移植后神經(jīng)干細(xì)胞的存活和分化情況

10、,宿主脊髓運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元存活情況,移植神經(jīng)段的軸突再生情況,觀察宿主脊髓損傷修復(fù)和巨噬細(xì)胞浸潤情況。
　　結(jié)果:脊髓半切損傷移植脛神經(jīng)后2周及4周,移植神經(jīng)干細(xì)胞或采用氯化鋰治療的大鼠下肢運(yùn)動(dòng)恢復(fù)較好,神經(jīng)干細(xì)胞移植聯(lián)合應(yīng)用氯化鋰對脊髓損傷大鼠下肢功能恢復(fù)的促進(jìn)作用更明顯。移植的脛神經(jīng)段與宿主脊髓整合良好,移植到脛神經(jīng)內(nèi)的神經(jīng)干細(xì)胞存活良好。氯化鋰促進(jìn)移植的NSC發(fā)出軸突長入宿主脊髓,促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞分化為NF200陽性的神經(jīng)元。與單純

11、脛神經(jīng)移植比較,神經(jīng)干細(xì)胞移植和氯化鋰治療組損傷側(cè)宿主脊髓神經(jīng)元數(shù)量明顯增多,移植神經(jīng)段內(nèi)NF200陽性神經(jīng)纖維明顯增多,移植部位GFAP膠質(zhì)瘢痕范圍較小,ED1表達(dá)也明顯減少。神經(jīng)干細(xì)胞移植聯(lián)合氯化鋰治療組的上述各指標(biāo)均高于其他各組。
　　結(jié)論:在脊髓半切損傷后移植含有神經(jīng)干細(xì)胞的脛神經(jīng)或氯化鋰治療能顯著促進(jìn)實(shí)驗(yàn)大鼠下肢功能的恢復(fù),顯著減少宿主脊髓運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元死亡,促進(jìn)軸突再生,抑制炎癥反應(yīng),縮小膠質(zhì)瘢痕的范圍。神經(jīng)干細(xì)胞移植聯(lián)合