苦蕎Ⅱ型金屬硫蛋白基因的功能及其啟動子活性分析.pdf

1、金屬硫蛋白(metallothioneins，MTs)是一類富含半胱氨酸的低分子量蛋白，在植物重金屬耐受性中發(fā)揮重要的作用?？嗍w(Fagopyrum tataricum)含有豐富的黃酮類物質(zhì)，是重要的藥食兩用作物，其具有耐瘠薄、抗重金屬等良好的抗逆性。但目前為止，尚未見有關(guān)于苦蕎重金屬抗逆機(jī)理和苦蕎金屬硫蛋白表達(dá)調(diào)控以及功能的相關(guān)研究報道。本研究通過克隆苦蕎Ⅱ型金屬硫蛋白基因序列（FtMT2），構(gòu)建FtMT2過表達(dá)的大腸桿菌、酵母及擬南

2、芥，并測定重組蛋白的羥自由基去除能力，以期揭示FtMT2在苦蕎重金屬耐受中的功能;通過FtMT2啟動子序列的克隆，預(yù)測啟動子區(qū)的順式作用元件，構(gòu)建不同截短啟動子的雙熒光素酶報告載體，采用瞬時轉(zhuǎn)化苦蕎葉肉細(xì)胞原生質(zhì)體研究FtMT2啟動子對Cu2+的響應(yīng)，以期揭示FtMT2基因啟動子活性的響應(yīng)模式。FtMT2的克隆及其啟動子的功能分析對于建立Cu2+污染的檢測技術(shù)具有參考價值，同時為解析苦蕎重金屬抗性的內(nèi)在機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。本研究得到的主要結(jié)

3、果和結(jié)論有:
　　(1)FtMT2基因含有3個外顯子和2個內(nèi)含子分隔，內(nèi)含子邊界符合“5'-GT”和“AG-3'”規(guī)則。FtMT2編碼區(qū)為237bp，編碼78個氨基酸;預(yù)測的編碼蛋白的分子質(zhì)量為7.885kD，等電點(diǎn)4.55，蛋白序列中含有14個Cys，在N-端含有“C-C，C-X-C，C-X-X-C”模體以及高度保守的“MSCCGGNCGCGS”序列，C-端含有3個“C-X-C”模體。N-端和C-端的結(jié)構(gòu)被42個氨基酸的連接區(qū)分

4、隔，這些均為植物Ⅱ型金屬硫蛋白的典型特征。蛋白序列的系統(tǒng)發(fā)育分析顯示其與雙子葉豆科植物田菁關(guān)系最近。
　　(2)生長曲線測定和平板菌落分析結(jié)果顯示，F(xiàn)tMT2過表達(dá)的大腸桿菌TOP10和釀酒酵母分別對Cu2+和Cd2+耐受性增加。暗示FtMT2在苦蕎對Cu2+和Cd2+的耐受性中發(fā)揮作用。
　　(3)FtMT2重組蛋白的羥自由基去除能力測定結(jié)果顯示，羥自由基去除率為50％時的蛋白濃度為46.5μg/mL。暗示FtMT2在苦蕎

5、氧化脅迫耐受性中發(fā)揮作用。
　　(4)通過Genome walking技術(shù)克隆得到了2.1kb的FtMT2啟動子，順式作用元件預(yù)測結(jié)果顯示，該啟動子區(qū)域脫落酸響應(yīng)元件(abscisic acid responsive element，ABRE)、茉莉酸甲酯響應(yīng)元件(methyl jasmonate responsive element，MeJa-RE)、熱休克響應(yīng)元件(heat stress responsive element，

6、HSE)以及參與光響應(yīng)的“ATCT-motif”、“TCT-motif”“GATA-motif”和“I-box”等。特別指出的是，該序列中存在3個金屬響應(yīng)元件相似序列(MRE-like sequence):“5'-TGCAG-3'”，該元件與動物MTs基因啟動子上參與重金屬響應(yīng)的元件相似。
　　(5)啟動子活性分析結(jié)果顯示，在無Cu2+處理?xiàng)l件下，不同截短體都具有啟動子活性，暗示FtMT2基因具有一定的本底表達(dá);在Cu2+處理?xiàng)l件

7、下，不同截短體的啟動子活性均顯著上調(diào)，其中包含3個金屬響應(yīng)元件(MRE)的2.1Kb截短體(FtMT2PR1)和2個MRE的1.6Kb截短體(FtMT2PR2)啟動子活性分別提高了6.38倍和6.15倍，含有1個MRE的1.4Kb截短體(FtMT2PR3)啟動子活性提高了3.01倍，而不含預(yù)測的金屬響應(yīng)元件的0.98Kb截短體(FtMT2PR4)啟動子活性也增加1.81倍。結(jié)果說明預(yù)測的金屬響應(yīng)元件可能存在劑量效應(yīng)，并且在啟動子序列中還

8、存在其它重要的金屬響應(yīng)元件響應(yīng)于Cu2+的處理。成功構(gòu)建了1.6kb啟動子及MRE突變體-gus報告基因的植物表達(dá)載體，并篩選到了T1代陽性轉(zhuǎn)基因擬南芥植株，為確定FtMT2的金屬響應(yīng)元件奠定了基礎(chǔ);同時為構(gòu)建重金屬響應(yīng)的報告系統(tǒng)提供基礎(chǔ)的元件。
　　(6)成功構(gòu)建pCAMBIA3301-FtMT2過表達(dá)載體，并篩選到陽性的擬南芥T2代轉(zhuǎn)基因植株，為研究FtMT2在植物體內(nèi)的生物學(xué)功能奠定了基礎(chǔ)。以苦蕎植株葉片為材料，采用農(nóng)桿菌注