乳酸桿菌表面蛋白調(diào)控腸上皮細(xì)胞粘附及其生物學(xué)意義.pdf

1、目的和意義： 應(yīng)用生物信息學(xué)及克隆表達(dá)的方法對(duì)乳酸桿菌表層粘附蛋白進(jìn)行篩選和鑒定，并通過(guò)抗體封閉及競(jìng)爭(zhēng)粘附的手段對(duì)目的蛋白的粘附作用作進(jìn)一步的驗(yàn)證。根據(jù)腸上皮細(xì)胞模型(Caco-2細(xì)胞)在單獨(dú)使用致病性大腸桿菌(EPEC)感染，加用乳酸桿菌或粘附蛋白后的生物學(xué)功能改變的不同，包括單層細(xì)胞的完整性和通透性、緊密連接(Tight jungtion，TJ)蛋白、F-actin、ERK、p-ERK的表達(dá)差異，闡述乳酸桿菌及粘附蛋白對(duì)腸上

2、皮細(xì)胞緊密連接蛋白及其生物學(xué)功能的調(diào)控機(jī)制。 研究方法： 1、運(yùn)用生物信息學(xué)及克隆表達(dá)的方法鑒定和篩選乳酸桿菌表層粘附蛋白； 2、通過(guò)同EPEC競(jìng)爭(zhēng)粘附腸上皮細(xì)胞，結(jié)合抗體封閉的手段驗(yàn)證目的蛋白的粘附作用； 3、采用免疫熒光、Western blot方法觀察EPEC、乳酸桿菌或粘附蛋白對(duì)腸上皮細(xì)胞緊密連接(TJ)相關(guān)蛋白Claudin-1蛋白、Occludin蛋白、JAM-1蛋白、ZO-1蛋白分布變化的影

3、響； FITC-phalloidin染色觀察細(xì)胞骨架F-actin的表達(dá)變化； 4、用Millipore ERS電阻儀測(cè)定單層細(xì)胞跨膜電阻值(TER)的變化；用高效液相色譜法(HPLC)測(cè)定甘露醇溶液的透過(guò)率間接反映單層細(xì)胞的通透性； 5、結(jié)合ERK表達(dá)水平的改變，分析乳酸桿菌對(duì)腸上皮TJ蛋白的調(diào)控機(jī)制 6、所有數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，P<0.05提示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，采用SPSS13.0版統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析

4、。 結(jié)果： 1、通過(guò)乳酸桿菌同腸上皮黏蛋白的粘附特性，對(duì)乳酸桿菌表層粘附蛋白作篩選及鑒定，運(yùn)用質(zhì)譜分析、分段表達(dá)克隆及Western blot找到粘附蛋白整合膜蛋白(IMP)，其粘附域位置是IMP的第二段(氨基酸序列的455-755)； 2、通過(guò)抗體封閉，在同EPEC的競(jìng)爭(zhēng)黏附實(shí)驗(yàn)中進(jìn)一步證實(shí)該段黏附蛋白對(duì)黏附有重要作用； 2、堿性磷酸酶染色驗(yàn)證了腸道上皮樣細(xì)胞Caco-2具有明顯的細(xì)胞極性。免疫膠體金及

5、電鏡觀察證實(shí)相鄰上皮細(xì)胞間的頂端存在緊密連接結(jié)構(gòu)； 3、EPEC感染可使相鄰Caco-2細(xì)胞間TJ結(jié)構(gòu)遭到破壞，TJ相關(guān)蛋白(Claudin-1蛋白，Occludin蛋白，JAM-1蛋白，ZO-1蛋白)的表達(dá)亦減少，細(xì)胞骨架受損，然而腸上皮細(xì)胞ERK的磷酸化水平隨緊密連接蛋白水平的降低而升高；而乳酸桿菌和表層粘附蛋白處理后可以減輕EPEC引起的TJ結(jié)構(gòu)及相關(guān)蛋白的破壞，ERK的磷酸化水平卻降低明顯； 4、EPEC感染Ca

6、co-2細(xì)胞后，單層細(xì)胞的TER值降低和甘露醇的透過(guò)率隨時(shí)間延長(zhǎng)而升高；而經(jīng)乳酸桿菌和表層粘附蛋白處理后，TER值恢復(fù)且甘露醇的透過(guò)率降低。 結(jié)論： 植物乳酸桿菌CGMCC No.1258表層黏附蛋白為整合膜蛋白，且該蛋白的粘附區(qū)域位于其第二段氨基酸序列中。乳酸桿菌依賴于粘附蛋白可以同EPEC競(jìng)爭(zhēng)粘附腸上皮細(xì)胞Caco-2，進(jìn)而可以抑制EPEC的感染后引起的腸道單層上皮完整性、細(xì)胞間緊密連接結(jié)構(gòu)和細(xì)胞內(nèi)骨架的破壞，其具體