化療對三陰性乳腺癌CD44+CD24--low亞群影響的實驗與臨床研究.pdf

1、目的：乳腺癌是女性常見的一種高度異質(zhì)性的惡性腫瘤,發(fā)病率逐年增加。三陰性乳腺癌（triple-negative breast cancer，TNBC）是指腫瘤細胞膜表面缺乏雌激素受體( estrogen receptor，ER)、孕激素受體(progesterone rcceptor,PR)和人表皮生長因子受體2（human epidermal growth factor receptor-2，HER2）的一類乳腺癌，具有術(shù)后易復(fù)發(fā)、易

2、遠處轉(zhuǎn)移和預(yù)后差的特點，對內(nèi)分泌治療和針對HER2的靶向治療無效，至今仍缺乏令人滿意的綜合治療方案。近年來提出的腫瘤干細胞(cancer stem cell CSC)理論認為腫瘤干細胞是惡性腫瘤的根源，因此，各種化療藥物對TNBC中腫瘤干細胞的影響至關(guān)重要，其最終可能決定著TNBC治療的成敗。目前多數(shù)研究表明CD44+CD24-/low表型的細胞是乳腺癌干細胞相關(guān)亞群。本研究觀察晚期乳腺癌臨床常用六種化療藥物對三陰性乳腺癌細胞株MDA-

3、MB-231的作用，并觀察上述藥物對乳腺癌干細胞相關(guān)亞群(CD44+CD24-/low細胞)含量變化的影響，同時檢測10例晚期轉(zhuǎn)移性三陰性乳腺癌患者化療前后外周血中CD44+CD24-/low亞群的水平變化，以期為臨床治療TNBC的藥物選擇提供依據(jù)。
　　 方法：
　　 1.體外培養(yǎng)人三陰性乳腺癌細胞株MDA-MB-231，選用六種晚期乳腺癌臨床常用化療藥物，分別為：紫杉醇(PTX)、多西紫杉醇(DOX)、5-氟尿嘧啶(

4、5-FU)、表柔比星(EPI)、長春瑞濱(NVB)、吉西他濱(GEM)。應(yīng)用四甲基偶氮唑藍(tetrzolium-based colorimetric assay，MTT)法測定各種藥物濃度為0.2、1、5倍的藥物血漿峰濃度(PPC)，分別作用24h、48h和72h對MDA-MB-231細胞的增殖抑制率。
　　 2.將細胞隨機分為對照組（正常條件下培養(yǎng)的MDA-MB-231細胞株）和六種化療藥物作用的實驗組，每組均同時設(shè)立10個

5、培養(yǎng)瓶細胞。六種化療藥物均以1倍PPC作為工作濃度，分別作用于MDA-MB-231，48小時后，觀察細胞形態(tài)學(xué)變化，并將每組中5瓶細胞用流式細胞儀檢測其CD44+CD24-/low細胞比例：剩余5瓶細胞在藥物作用48小時后，去除藥物作用，加入新的培養(yǎng)基，在正常培養(yǎng)條件下繼續(xù)培養(yǎng)至細胞復(fù)蘇，以鏡下觀察每瓶細胞中貼壁細胞數(shù)量約占瓶底面積的80％為標準，然后用流式細胞儀檢測各組中CD44+CD24-/low細胞比例。
　　 3.應(yīng)用流

6、式細胞術(shù)檢測10例晚期轉(zhuǎn)移性三陰性乳腺癌患者化療前和化療后外周血中CD44+CD24-/low細胞含量，另采集10例健康志愿者血樣作為正常對照進行比較。
　　 結(jié)果：
　　 1.MTT分析結(jié)果顯示，與對照組相比，PTX、DOX、EPI、5-FU、NVB、GEM在0.2、1、5倍PPC作用24、48、72小時后，對MDA-MB-231細胞增殖均有明顯的抑制作用(p＜0.05)，且隨著藥物濃度的增加，抑制率也增加。在1倍的P

7、PC作用48小時后，對MDA-MB-231的抑制作用以PTX最為明顯。
　　 2.流式細胞儀檢測結(jié)果顯示：對照組CD44+CD24-/low細胞含量為：86.46％±4.72％。各藥于1倍PPC作用48h后的CD44+CD24-/low細胞亞群含量分別為：NVB（91.34％±4.17％）、GEM（85.43％±2.76％）、DOX(74.78％±398％)、PTX(71.67％±1.87％)、EPI(66.38％±3.06％)

8、、5-FU(42.41％±5.43％)。統(tǒng)計結(jié)果顯示NVB作用后雖能使細胞含量增加，但與對照組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，GEM作用后未使細胞含量發(fā)生明顯變化與對照組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，其余各組均使細胞含量減低，與對照組比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(p＜0.05)，其中以5-FU作用后減低最為明顯。終止藥物作用，正常條件下繼續(xù)培養(yǎng)至細胞復(fù)蘇，流式細胞儀檢測的各組CD44+CD24-/low細胞含量分別為：NVB（8

9、6.46％±2.58％）、GEM(85.97％±3.80％)、DOX(75.23％±2.91％)、PTX(69.21％±5.55％)。統(tǒng)計結(jié)果顯示NVB組CD44+CD24-/low細胞含量與正常對照相似，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，GEM組細胞含量與對照組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，DOX和PTX組細胞含量低于正常，與對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(p＜0.05)。EPI和5-FU組細胞未恢復(fù)正常生長（重復(fù)培養(yǎng)3次）。

10、r>　　 3.10例患者在化療2周期后療效評價均為疾病穩(wěn)定（SD，腫瘤均有不同程度的縮?。?。10例晚期轉(zhuǎn)移性三陰性乳腺癌患者外周血中化療前和化療后CD44+CD24-/low細胞含量分別為：54～793個/100ul和13～198個/100ul，中位數(shù)分別為：160個/100ul和48個/100ul。10例健康志愿者外周血中CD44+CD24-/low細胞含量在13～41個/100ul之間，中位數(shù)為28個/100ul。統(tǒng)計結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)

11、移性三陰性乳腺癌患者外周血中CD44+CD24-/low細胞含量高于健康志愿者(p＜0.05)。乳腺癌患者化療后外周血中CD44+CD24-/low細胞含量較化療前降低(p＜0.05)。
　　 結(jié)論：
　　 1.六種化療藥物在0.2、1、5倍PPC作用24、48、72小時后，對MDA-MB-231細胞增殖均有明顯的抑制作用，隨著藥物濃度的增加，抑制率增加。1倍的PPC作用48小時，對MDA-MB-231的抑制作用以PTX

12、最為明顯。
　　 2.三陰性乳腺癌細胞株MDA-MB-231中CD44+CD24-/llow細胞亞群作為乳腺癌干細胞相關(guān)亞群并非對所有的化療藥物產(chǎn)生抵抗，化療藥物PTX、DOX、EPI、5-FU均可使其含量降低，以5-FU作用最為明顯。
　　 3.晚期轉(zhuǎn)移性三陰性乳腺癌患者血液中CD44+CD24-/low乳腺癌干細胞相關(guān)亞群含量高于健康志愿者?；熆墒谷橄侔┗颊咄庵苎蠧1)44+CD24-/low細胞含量降低。血液中