內(nèi)分泌及化療對ER+乳腺癌CD44+CD24+-low細(xì)胞亞群的實驗與臨床研究.pdf

1、目的:乳腺癌是婦女常見的惡性腫瘤,全球流行病學(xué)研究表明,在女性惡性腫瘤中,乳腺癌的發(fā)病率和死亡率均居首位。腫瘤干細(xì)胞假說認(rèn)為腫瘤干細(xì)胞是惡性腫瘤復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移的根源。目前越來越多的研究證實CD44+CD24-/low表型的細(xì)胞是乳腺癌干細(xì)胞相關(guān)亞群。內(nèi)分泌治療是雌激素受體陽性(estrogen receptor positive,ER+)乳腺癌患者不可或缺的治療手段。本實驗探討雌二醇(estradiol,E2)、三苯氧胺(tamoxifen

2、,TAM)及晚期乳腺癌化療常用的藥物對雌激素受體陽性的人乳腺癌細(xì)胞株MCF-7中CD44+CD24-/low細(xì)胞亞群的影響,為臨床ER+乳腺癌用藥提供參考。同時探討雌激素受體陽性的晚期乳腺癌患者外周血中CD45-CD44+CD24-/low細(xì)胞亞群與臨床治療的相關(guān)性,以預(yù)測晚期乳腺癌患者化療療效。
　　 方法:
　　 1：體外培養(yǎng)ER+人乳腺癌細(xì)胞株MCF-7,選取對數(shù)生長期細(xì)胞進行試驗。實驗分對照組、E2組和E2+TA

3、M組。對照組加入與實驗組相同劑量的藥物溶劑(無水乙醇),E2組分別加入10-7mol/L,10-8mol/L,10-9mol/L的雌激素,E2+TAM組分別在E2組三個濃度基礎(chǔ)上加10-6mol/L的TAM。培養(yǎng)10天及20天后分別用流式細(xì)胞儀檢測各組中CD44+CD24-/low細(xì)胞亞群的比例。
　　 2：選取經(jīng)終濃度10-8mol/L雌激素的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)10天的對數(shù)生長期細(xì)胞MCF-7進行試驗。選擇晚期乳腺癌化療常用的

4、藥物:多西紫杉醇(DTX),紫杉醇(PTX),阿霉素(EPI),氟尿嘧啶(5-Fu)為實驗用藥。應(yīng)用四甲基偶氮唑藍(tetrzolium-based colorimetric assay MTT)法分別測定各藥物不同濃度的抑制率,選擇各藥物抑制率為50％(IC50)時的濃度為工作濃度,并以此濃度進行試驗。實驗分為對照組,24小時組及20天組。對照組加入相同劑量的藥物溶劑,24小時組及20天組分別加入工作濃度的藥物。24小時組24小時后用

5、流式細(xì)胞儀檢測各組中CD44+CD24-/low細(xì)胞亞群的比例;20天組24小時后終止藥物作用,繼續(xù)培養(yǎng)19天后處理同24小時組。
　　 3：采集雌激素受體陽性的復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移性乳腺癌患者化療第一周期前一天及化療第三周期前一天的外周靜脈血5ml。流式細(xì)胞儀檢測各標(biāo)本組中CD45-CD44+CD24-/low細(xì)胞亞群的比例,分析其與臨床治療的相關(guān)性,預(yù)測化療療效。
　　 結(jié)果:
　　 1：人乳腺癌細(xì)胞株MCF-7中CD4

6、4+CD24-/low細(xì)胞亞群的比例為:(0.59±0.39)％。不同濃度E2組培養(yǎng)10天時,MCF-7中CD44+CD24-/low細(xì)胞亞群的比例分別為:(8.16±0.31)％,(9.61±0.66)％,(7.10±0.21)％。與對照組相比均升高(P＜0.05)。E2+TAM組作用10天后CD44+CD24-/low細(xì)胞亞群的比例的分別為:(5.73±0.59)％,(8.12±1.33)％,(6.11±0.44)％。與相應(yīng)濃度E2

7、組相比均下降(P＜0.05)。不同濃度E2組培養(yǎng)20天后,MCF-7中CD44+CD24-/low細(xì)胞亞群的比例的分別為:(8.46±0.49)％,(9.66±0.50)％,(7.60±0.64)％與對照組相比均升高(P＜0.05)。E2+TAM組作用20天后CD44+CD24-/low細(xì)胞亞群的比例的分別為:(5.73±0.70)％,(7.73±0.64)％,(5.96±0.49)％與相應(yīng)濃度E2組相比CD44+CD24-/low細(xì)胞

8、亞群的比例均下降(P＜0.05)。
　　 2：MTT結(jié)果顯示:在一定濃度范圍內(nèi),不同濃度的DTX,PTX,5-Fu,EPI對MCF-7細(xì)胞作用24小時后,各藥物均呈現(xiàn)劑量-效應(yīng)依賴關(guān)系,其中DTX,5-Fu,EPI呈線性相關(guān),PTX呈對數(shù)相關(guān)。為確保實驗中各藥物對MCF-7細(xì)胞的處理因素相同,選擇各藥物IC50的濃度為工作濃度。應(yīng)用相關(guān)分析得出藥物濃度與抑制率關(guān)系的方程,計算各藥物IC50分別為:DTX:3.22ug/mL,PT

9、X.1.89ug/mL,5-Fu:55.46ug/mL,EPI:0.827ug/mL。以10-8mol/L的E2作用于MCF-710天及30天后的CD44+CD24-/low細(xì)胞亞群的比例為對照。24d小時后各藥物組CD44+CD24-/low細(xì)胞亞群的比例(DTX,PTX,5-Fu,EPI)分別為:(12.21±1.10)％,(23.42±2.76)％,(54.25±1.91)％,(41.37±1.57)％與對照組相比均升高(P＜0.

10、05),5-FU使MCF-7中CD44+CD24-/low細(xì)胞亞群的比例升高最明顯,DTX使MCF-7中CD44+CD24-/low細(xì)胞亞群的比例變化最小。20天后CD44+CD24-/low細(xì)胞亞群的比例分別為(DTX,PTX,5-Fu,EPI):(8.68±0.90)％,(8.08±0.82)％,(15.30±1.06)％,(14.39±1.45)％與對照組相LLDTX、PTX雖有所降低,但差別無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05);5-Fu

11、、EPI與對照相比升高(P＜0.05)。
　　 3：健康志愿者外周血中CD45-CD44+CD24-/low細(xì)胞亞群比例為:(1.80±0.10)％,20例患者化療前的CD45-CD44+CD24-/low細(xì)胞亞群比例為:(6.49±1.77)％,明顯高于健康志愿者(P＜0.05)。20例患者中疾病穩(wěn)定(stabledisease,SD)11例,部分緩解(partial response,PR)7例,疾病進展(progressi

12、on disease,PD)2例。PR及SD患者外周血中CD45-CD44+CD24-/low細(xì)胞亞群比例化療后與化療前相比均有不同程度下降,且差別有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。兩例PD患者外周血中CD45-CD44+CD24-/low細(xì)胞亞群比例均升高,但是由于病例數(shù)較少無法得出確切結(jié)論。
　　 結(jié)論:
　　 1：不同濃度雌激素能夠使MCF-7中CD44-CD24-/low細(xì)胞亞群的比例升高,相同濃度的雌激素作用下添加

13、三苯氧胺能夠降低MCF-7中CD44+CD24-/low細(xì)胞亞群的比例。
　　 2：MCF-7中的CD44+CD44-/low細(xì)胞亞群對多西他賽、紫杉醇、氟尿嘧啶及阿霉素均有抵抗能力。多西他賽及紫杉醇對MCF-7中CD44+CD24-/low細(xì)胞亞群的比例影響不明顯,而氟尿嘧啶及阿霉素能夠明顯升高CD44+CD24-/low細(xì)胞亞群的比例。
　　 3：雌激素受體陽性的晚期乳腺癌患者外周血中CD45-CD44+CD24-/