AKT-1和STAT-1介導(dǎo)乳腺癌始動(dòng)細(xì)胞CD44+-CD24--low輻射抵抗的相關(guān)性研究.pdf

1、目的：本研究通過對乳腺癌干細(xì)胞進(jìn)行51種相關(guān)輻射抵抗基因的qRT-PCR篩選，并針對AKT-1和STAT-1與乳腺癌干細(xì)胞的輻射抵抗關(guān)系進(jìn)行探討。
　　 方法：
　　 1、懸浮培養(yǎng)聯(lián)合放射線富集具放射抵抗的乳腺癌干細(xì)胞
　　 MCF-7細(xì)胞復(fù)蘇后加入完全培養(yǎng)基，分別用有無血清的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，至對數(shù)生長期時(shí)制成單細(xì)胞懸液，準(zhǔn)備流式染色。一部分懸浮培養(yǎng)細(xì)胞經(jīng)varian2100C/D以300-500cGy/min的劑

2、量率照射8Gy后繼續(xù)懸浮培養(yǎng)，分別檢測第二代、第四代、第五代、第六代、第七代的CD44+/CD24-/low的含量。
　　 2、對乳腺癌干細(xì)胞進(jìn)行51種與腫瘤增殖及周期調(diào)控有關(guān)的基因表達(dá)微陣列分析
　　 采用Primer premier 5軟件設(shè)計(jì)引物，由invitrogen公司合成51種與腫瘤增殖及周期調(diào)控有關(guān)的基因微陣列組成(具體見正文)。對MCF-7普通培養(yǎng)和懸浮培養(yǎng)的球囊細(xì)胞照射前后分別提取細(xì)胞RNA，應(yīng)用熒光定

3、量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(qR-PCR)進(jìn)行51種與腫瘤增殖及周期調(diào)控有關(guān)的基因表達(dá)微陣列分析。
　　 3、STAT1與AKT1在乳腺癌始動(dòng)細(xì)胞CD44+/CD24-/low的表達(dá)水平
　　 對MCF-7普通培養(yǎng)和懸浮培養(yǎng)的球囊細(xì)胞照射前后應(yīng)用qRT-PCR重復(fù)檢測STAT1與AKT1的mRNA表達(dá)水平，并應(yīng)用SPSS 13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，采用student's t檢驗(yàn)分析STATI與AKT1在MCF-7與球囊細(xì)胞

4、照射前后的表達(dá)水平。
　　 4、加用STAT1與AKT1抑制劑后對乳腺癌始動(dòng)細(xì)胞CD44+/CD24-/low放射生物學(xué)特性的影響
　　 分別在MCF-7和球囊細(xì)胞中加用STAT1和AKT1抑制劑后，對標(biāo)本照射前后Annexin V-100 FITC /PI流式細(xì)胞儀法檢測細(xì)胞凋亡、檢測克隆形成率和生存曲線，并應(yīng)用SPSS 13.0軟件和Grap head Prism(4.0)統(tǒng)計(jì)軟件處理。
　　 5、統(tǒng)計(jì)方法：

5、所有數(shù)據(jù)均以均值x±SD表示，應(yīng)用student's t檢驗(yàn)分析，P≤0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　 結(jié)論：
　　 1.懸浮培養(yǎng)聯(lián)合放射線照射得到的干細(xì)胞比例高達(dá)98％,穩(wěn)定于90％左右。
　　 2.BC1-2,BRCA-1,Stat1,Ing1,E2F1,AKT1,HDAC1,Kit與乳腺癌干細(xì)胞的放療抵抗可能有關(guān)。
　　 3.AKT1和STAT1與乳腺癌干細(xì)胞的放射抵抗密切相關(guān),阻斷各自的通路有可能加

6、強(qiáng)乳腺癌的放療效果。
　　 本研究的創(chuàng)新之處：
　　 1、利用懸浮培養(yǎng)聯(lián)合放射線照射成功富集了乳腺癌干細(xì)胞,比之前所有的分離方法得率都高。
　　 2、第一次應(yīng)用qRTPCR的方法定量檢測乳腺癌干細(xì)胞的相關(guān)放療抵抗基因,發(fā)現(xiàn)BC1-2,BRCA-1,Stat1,Ing1,E2F1,AKT1,HDAC1,Kit與有關(guān)。
　　 3、分別應(yīng)用AKT1和STAT1特異性抑制劑來抑制P13K/Akt、JAK/STAT