天花粉蛋白基因的克隆及其突變體在大腸桿菌中的表達(dá).pdf

1、目的：天花粉蛋白(TCS)是一種單鏈核糖體失活蛋白，它能抑制真核生物蛋白質(zhì)合成，并具有廣譜的抗病毒活性。近期研究發(fā)現(xiàn)TCS可專一性地殺死被HIV感染的細(xì)胞，而對正常細(xì)胞無作用。本實(shí)驗(yàn)利用PCR技術(shù)從栝樓基因組DNA中擴(kuò)增出TCS基因，成功構(gòu)建了克隆載體和表達(dá)載體，并建立了TCS隨機(jī)突變文庫，這為TCS的原核表達(dá)奠定了分子生物學(xué)的基礎(chǔ)。 方法： 1)．從新鮮栝樓葉片中獲取TCS基因組DNA，利用PCR技術(shù)擴(kuò)增其全長基因，與

2、載體pUCm-T連接，轉(zhuǎn)化感受態(tài)E.coli DH5a，提取質(zhì)粒進(jìn)行測序； 2)．用PCR法克隆TCS成熟肽基因(CDS)，經(jīng)NcoⅠ和HindⅢ雙酶切后連接經(jīng)同樣雙酶切的pET-28a(+)載體，轉(zhuǎn)化Ecoli DH5a，陽性鑒定后將所獲陽性重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化感受態(tài)Ecoli BL21(DE3)得到工程菌，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)后，對表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行SDS-PAGE分析； 3)．采用易錯(cuò)PCR技術(shù)構(gòu)建TCS基因和活性中心隨機(jī)突變文庫