天花粉蛋白突變基因TCS-,A-S-在煙草中的表達(dá)、定位及抗性鑒定.pdf

1、天花粉蛋白(Trichosanthin，TCS)屬于Ⅰ型植物核糖體失活蛋白(RibosomeInactivating Protein，RIP)，主要從藥用植物栝樓(Trichosanthes kirilowii)的塊根和葉中提取出來，是一種抗濾過性病原體的植物防御蛋白。本研究應(yīng)用轉(zhuǎn)基因技術(shù)，以普通煙草品種K326和三生煙為外植體，將栝樓天花粉蛋白的突變基因TCS<,A-S>與Gus基因融合，通過根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化煙草，獲得了含有目標(biāo)基因

2、插入序列的煙草轉(zhuǎn)化體，通過分子生物學(xué)驗(yàn)證、細(xì)胞學(xué)檢測(cè)以及抗病性試驗(yàn)，研究TCS基因的氨基酸序列、結(jié)構(gòu)、功能及其抗病性機(jī)制。主要研究結(jié)果如下： 1、采用葉盤法，通過根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)將含有TCS<,A-S>基因的雙元載體pCambia1301/3132-1轉(zhuǎn)化煙草，在25mg/L潮霉素的篩選條件下，K326和三生煙的轉(zhuǎn)化率分別達(dá)到55.9％和72.4％，不含有TCS<,A-S>基因的空白載體pCambia 1301的轉(zhuǎn)化率達(dá)到75.2

3、％。 2、根據(jù)突變基因TCS<,A-S>基因序列設(shè)計(jì)特異引物，對(duì)12株煙草轉(zhuǎn)化體進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得含有目標(biāo)序列、長(zhǎng)度為819bp的擴(kuò)增片段。轉(zhuǎn)化載體DNA和擴(kuò)增產(chǎn)物DNA測(cè)序表明，插入基因的核苷酸序列沒有發(fā)生堿基的改變。X-gluc的組織化學(xué)法染色，均能檢測(cè)到Gus基因在轉(zhuǎn)基因植株的根、莖、葉中的表達(dá)。表明TCS<,A-S>與Gus融合基因已成功轉(zhuǎn)入煙草的基因組中，其編碼蛋白116和161位點(diǎn)的突變并不影響基因整合和表達(dá)。

4、 3、對(duì)Gus染色組織進(jìn)行石蠟切片，鏡檢結(jié)果表明，含有TCS<,A-S>基因的pCambia1301/3132-1轉(zhuǎn)化植株中，TCS<,A-S>與Gus基因的融合蛋白主要在葉片組織中的氣孔、皮層的薄壁細(xì)胞及表皮毛頂端獲得表達(dá)。表明煙草轉(zhuǎn)化體中突變基因TCS<,A-S>的表達(dá)產(chǎn)物具有一定的細(xì)胞特異性，其編碼蛋白的前導(dǎo)序列對(duì)于蛋白產(chǎn)物在細(xì)胞中的分布具有一定的影響。 4、病毒接種試驗(yàn)結(jié)果表明，含有TCS<,A-S>基因的pCamb

5、ia 1301/3132-1煙草轉(zhuǎn)化植株、不含有TCS<,A-S>基因的pCambia 1301煙草轉(zhuǎn)化植株以及對(duì)照K326植株，在接種TOMV和CMV以后，均表現(xiàn)出系統(tǒng)花葉的感病癥狀。接種植株的SDS-PAGE電泳顯示，感病植株能夠分離出ToMV和CMV的外殼蛋白。因此，TCS基因編碼蛋白116和161位點(diǎn)氨基酸的突變，導(dǎo)致煙草轉(zhuǎn)化植株失去了對(duì)病毒ToMV和CMV的抗病性--說明TCS蛋白116和161位點(diǎn)的氨基酸涉及該蛋白對(duì)病毒的特