桃pgip基因cDNA的克隆及其在大腸桿菌中的表達.pdf

1、多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白(Polygalacturonase inhibiting proteins，PGIPs)是一種胞外的細胞壁結(jié)合糖蛋白，在植物的防衛(wèi)反應中具有重要的作用。它能夠特異性結(jié)合病原真菌分泌的內(nèi)切多聚半乳糖醛酸酶并抑制其水解活性，限制植物致病真菌的生長，同時引發(fā)植物的防衛(wèi)反應。它還與大多數(shù)植物抗性基因一樣，屬于富亮氨酸重復(Leucine-rich repeat，LRR)蛋白超家族。pgip基因在植物抗病育種中已成為一重

2、要的候選基因，其分離鑒定是進行轉(zhuǎn)基因研究的基礎。 根據(jù)李屬pgip基因序列保守區(qū)域設計一對特異引物，以桃(Prunuspersica(L.)：Batch)葉片制備的總RNA為模板，采用反轉(zhuǎn)錄.聚合酶鏈式反應(Reverse transcription-polymerasechain reaction，RT-PCR.)技術，克隆到了約1，000 bp的cDNA片段。該片段與pMD 18-T載體連接后轉(zhuǎn)化Escherichia co

3、li JMl09，對篩選到的陽性克隆進行序列測定與分析結(jié)果表明，獲得的cDNA長1，053 bp，是桃的pgip基因，命名為PPPgip，GenBank登錄號為EF409977。該片段含完整的開放閱讀框990 bp，編碼330個氨基酸殘基組成的蛋白質(zhì)，具有7個潛在的N.糖基化位點。預測該蛋白質(zhì)分子量為36.4 kDa，等電點為7.42，N端24個氨基酸殘基構成的疏水區(qū)域為信號肽。序列同源比對結(jié)果顯示，所克隆的Pppgip基因與李屬其它p

4、gip基因核苷酸序列的同源性為93.2～94.6％，推導氨基酸序列的同源性為89.7～92.7％；同源樹表明其明顯區(qū)別于其它pgip基因；進一步的系統(tǒng)進化樹分析表明，所克隆的PPPgip基因與馬哈利櫻桃(P.mahaleb L.)的pgip基因關系較近，而與壽星桃(P. persica L.vat.densa Makino)、桃栽培品種‘久?！?P.persica(L.)Batch)等pgip基因都存在較遠的進化關系。采用SyPred3

5、D軟件預測了該基因所編碼的蛋白質(zhì)的三維結(jié)構，表明PpPGIP的三維模型類似馬蹄形的結(jié)構，含11段α-螺旋和21段p.折疊，具有8個β-折疊/β-轉(zhuǎn)角/β-折疊/α-螺旋區(qū)，中心LRR結(jié)構域由lO個串聯(lián)的LRRs基序組成。 將該基因成熟肽編碼區(qū)序列克隆到pET-32a(+)表達載體中，分別構建了融合表達質(zhì)粒(pET-FPGIP)和非融合表達質(zhì)粒(pET-PGIP)，在E coli：Rosetta-gami(DE3)pLysS中通過