天花粉蛋白基因表達(dá)載體的構(gòu)建及轉(zhuǎn)化楊樹的研究.pdf

1、楊樹在我國(guó)分布廣泛，種類繁多，繁殖容易，栽培簡(jiǎn)便，適應(yīng)性強(qiáng)，生長(zhǎng)速度快，材質(zhì)優(yōu)良，是用材、防風(fēng)、綠化的主要造林樹種。但楊樹的病蟲害種類繁多，危害嚴(yán)重，加之長(zhǎng)期使用有機(jī)化學(xué)農(nóng)藥，更給我國(guó)的林業(yè)生產(chǎn)和生態(tài)建設(shè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。所以，楊樹病蟲害防治是目前林業(yè)生產(chǎn)亟待解決的問題，也是林木遺傳育種工作者的首要任務(wù)。 天花粉蛋白(Trichosanthin，TCS)是從葫蘆科藥用植物栝樓(TrichosantheskirilowiiMa

2、xim)塊根中分離得到的單鏈核糖體失活蛋白(RibosomeInactivatingProtein，RIP)，能夠抗煙草花葉病毒等7種病毒、稻瘟病菌等9種病原真菌及蚜蟲等4類害蟲。利用基因工程手段，將具有抗病和抗蟲特性的天花粉蛋白基因轉(zhuǎn)入楊樹，增強(qiáng)楊樹抗逆性，使楊樹免遭病蟲危害，具有無污染，不殺傷天敵，保護(hù)生物多樣性，維持生態(tài)平衡等特點(diǎn)，且意義重大。 本研究構(gòu)建了含有TCS啟動(dòng)子及結(jié)構(gòu)基因的植物表達(dá)載體pC-tPro-TCS-G

3、US和pC-tPro-TCS，及受PAL(PhenylalanineAmmonia-Lyase)誘導(dǎo)型啟動(dòng)子調(diào)控的植物表達(dá)載體pC-pPro-2-TCS、pC-pPro-1-TCS-GUS和pC-pPro-1-TCS。pC-tPro-TCS-GUS是在pCambia1381表達(dá)載體的GUS報(bào)告基因上游嵌合入TCS啟動(dòng)子及結(jié)構(gòu)基因而成。pC-tPro-TCS是在pCambia1301多克隆位點(diǎn)中插入TCS啟動(dòng)子及結(jié)構(gòu)基因，該基因下游不具有

4、GUS報(bào)告基因。pC-pPro-2-TCS是在pPPG表達(dá)載體的PAL誘導(dǎo)型啟動(dòng)子下游嵌合入TCS基因，TCS基因在串聯(lián)啟動(dòng)子PAL控制下；在天花粉蛋白基因的起始密碼子ATG前12bp處有原載體中的起始密碼子ATG，表達(dá)后形成了4個(gè)融合的氨基酸位于重組天花粉蛋白的N端；TCS基因下游為轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)。pC-pPro-1-TCS和pC-pPro-1-TCS-GUS是將TCS基因插入到pPPG表達(dá)載體的PAL啟動(dòng)子的非翻譯區(qū)與GUS報(bào)告基因上

5、游，TCS基因在串聯(lián)啟動(dòng)子PAL控制下；天花粉蛋白基因的起始密碼子與原載體中的起始密碼子是同一ATG，在重組天花粉蛋白的N端不會(huì)形成融合的氨基酸。在表達(dá)載體pC-pPro-1-TCS-GUS中，TCS基因下游沒有轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)，具有GUS報(bào)告基因；在表達(dá)載體pC-pPro-1-TCS中，TCS基因下游有轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)。 將構(gòu)建好的植物表達(dá)載體轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌LBA4404，提質(zhì)粒進(jìn)行特異引物PCR擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增結(jié)果驗(yàn)證了植物表達(dá)載體pC