天蠶素A-蛙皮素雜合肽及其突變體在大腸桿菌中的融合表達(dá).pdf

1、目的：優(yōu)化設(shè)計CA-MA雜合肽基因，尋找合適的突變位點，利用PCR技術(shù)對CA-MA基因進(jìn)行定點突變，并將天然型(CA-MA)與突變型(W16-CA-MA)分別在大腸桿菌中融合表達(dá)，進(jìn)行初步的純化，為進(jìn)一步研究CA-MA結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系奠定基礎(chǔ)。 方法:根據(jù)Genebank中CA-MA DNA序列及氨基酸殘基序列，按照Codon Usage Database中大腸桿菌偏愛密碼子原則對CA-MA基因進(jìn)行優(yōu)化設(shè)計。利用基因重組技術(shù)構(gòu)建

2、克隆重組體pUC-18-CA-MA，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5a中，經(jīng)a 互補(bǔ)篩選，挑出陽性菌落，抽提重組質(zhì)粒鑒定后測序；構(gòu)建表達(dá)重組體pGEX-4T-1-CA-MA，轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21，經(jīng)篩選后挑取菌落，抽提重組質(zhì)粒鑒定后測序。根據(jù)CA-MA結(jié)構(gòu)，尋找合適的突變位點，設(shè)計突變引物，利用反轉(zhuǎn)PCR定點突變技術(shù)，采用TaKaRa MutantBEST Kit對重組體pGEX-4T-1-CA-MA中CA-MA的第16位密碼子由AGT變?yōu)門GG。

3、將突變體轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21中，挑出陽性菌落，抽提重組質(zhì)粒鑒定后測序。將兩種陽性的重組轉(zhuǎn)化菌落用IPTG 37℃誘導(dǎo)表達(dá)， SDS-PAGE電泳觀察表達(dá)結(jié)果。抽提全菌體蛋白，用GSTrapFF親和層析柱純化得到GST-CA-MA和突變體GST-W16-CA-MA融合蛋白。 結(jié)果： 1、獲得優(yōu)化的CA-MA DNA片段，大小為66bp；構(gòu)建了克隆重組體pUC-18-CA-MA，經(jīng)酶切和DNA測序鑒定，結(jié)果表明與預(yù)先設(shè)計的

4、DNA序列完全一致。 2、CA-MA基因與表達(dá)載體連接，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21，抽提重組質(zhì)粒，經(jīng)酶切和DNA測序鑒定，結(jié)果表明表達(dá)重組體pGEX-4T-1-CA-MA構(gòu)建成功，CA-MA基因與表達(dá)載體連接方向正確，可以進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。 3、成功實現(xiàn)了對CA-MA基因的定點突變，獲得突變型表達(dá)重組體pGEX-4T-1-W16-CA-MA，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21中，測序結(jié)果表明CA-MADNA序列中第16位密碼子由AGT變?yōu)門

5、GG，達(dá)到預(yù)期突變結(jié)果。W16-CA-MA基因與表達(dá)載體連接方向正確，可以進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。 4、兩種表達(dá)菌經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)3～5h后，SDS-PAGE電泳結(jié)果可見約29KD的融合蛋白條帶，表達(dá)的融合蛋白經(jīng)GSTrapFF親和層析柱純化后電泳，表明融合蛋白以包涵體形式存在。 結(jié)論：成功構(gòu)建了表達(dá)重組體pGEX-4T-1-CA-MA及突變型表達(dá)重組體pGEX-4T-1-W16-CA-MA，并在大腸桿菌中誘導(dǎo)表達(dá)成功。初步得到