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1、肌內(nèi)脂肪(Intramuscular fat,IMF)是形成牛肉大理石花紋的物質(zhì)基礎(chǔ),是影響牛肉嫩度和風(fēng)味的一個(gè)主要因素。不同肌內(nèi)脂肪含量的個(gè)體肌肉組織基因的表達(dá)模式存在差異;閹牛與公牛相比,肌內(nèi)脂肪增加,肉的嫩度增加,提高了牛肉等級(jí)。隨著人們對(duì)基因結(jié)構(gòu)和功能的深入研究,這些差異的產(chǎn)生應(yīng)是基因的差異表達(dá)的結(jié)果。因此,本試驗(yàn)以相同月齡、同一飼養(yǎng)條件下的延邊黃牛背最長(zhǎng)肌為材料,利用 GeneFishing差異顯示技術(shù)對(duì)肌內(nèi)脂肪含量差異極顯著
2、的個(gè)體間以及閹牛和公牛背最長(zhǎng)肌進(jìn)行了差異表達(dá)基因的篩選、克隆和鑒定,取得了如下結(jié)果:
1、試驗(yàn)選取30頭28月齡延邊黃牛閹牛分別選取肌內(nèi)脂肪含量最高和最低各3個(gè)個(gè)體組成兩組,其平均肌內(nèi)脂肪含量分別為17.58%±0.14%和5.16%±0.32%,組間差異極顯著(P<0.01)。采用G e n e F i s h i n g技術(shù),分析了兩組個(gè)體背最長(zhǎng)肌組織差異表達(dá)基因。利用40對(duì)隨機(jī)引物差異顯示擴(kuò)增下,共獲得12條ESTs,通
3、過(guò)NCBI比對(duì)發(fā)現(xiàn)其中8個(gè)為已知的ESTs,這些差異基因主要包括5類(lèi):細(xì)胞骨架形成相關(guān)基因(Titin,ACTA1),細(xì)胞因子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)基因(ASB12),轉(zhuǎn)錄復(fù)合體相關(guān)基因(RPS14、RPS26和RPLP1),細(xì)胞能量代謝密切相關(guān)基因(COX4),未知功能蛋白Glutamyl tRNA Synthetase基因和4個(gè)未知基因。
2、從30頭延邊黃牛閹牛中選取肌內(nèi)脂肪含量最高和最低的9個(gè)個(gè)體組成兩組,肌內(nèi)脂肪含量分別為13
4、.26%±0.28%和4.65%±0.18%(P<0.05)。通過(guò)RT-PCR和實(shí)時(shí)定量PCR定性和定量檢測(cè)個(gè)體基因表達(dá)水平。熒光定量PCR結(jié)果顯示ASB12和Titin基因mRNA表達(dá)水平與肌內(nèi)脂肪含量呈正相關(guān)關(guān)系;Glutamyl tRNA Synthetase、RPLP1和ACTA1基因mRNA表達(dá)水平與肌內(nèi)脂肪含量呈負(fù)相關(guān)關(guān)系。
3、利用半定量 RT-PCR技術(shù)對(duì)所獲得的差異表達(dá)基因進(jìn)行了不同組織(背最長(zhǎng)肌、心臟、肝臟
5、、脾臟、肺臟、腎臟、小腸和瘤胃)間的表達(dá)分析。
4、利用ORF Finder、CLUSTALW等軟件對(duì)牛ACTA1、ASB12和 GlutamyltRNA Synthetase基因結(jié)構(gòu)、所編碼的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)、功能、系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)等特征進(jìn)行了預(yù)測(cè)和分析,并進(jìn)行了系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)的構(gòu)建。
5、利用比較基因組學(xué)和 PCR技術(shù),克隆了 ACTA1、Titin、ASB12和GlutamyltRNASynthetase基因的部分基因組序列,
6、并分析了這4個(gè)基因在延邊黃牛群體中的多態(tài)性:(1)ACTA1,1598bp,GenBank登錄號(hào)為HQ608159,在其上發(fā)現(xiàn)了2個(gè) S N P s位點(diǎn),第193位 A→G突變和第288位A→G突變。(2)Titin發(fā)現(xiàn)了3個(gè) SNP位點(diǎn),分別為第45003位 A→G突變,第70541位 A→G突變和第70553位 C→A突變。(3)ASB12發(fā)現(xiàn)了3個(gè) SNPs位點(diǎn),分別為第712位 T→C突變,第886位 G→C突變和第1042位
7、C→T突變。(4)GlutamyltRNASynthetase發(fā)現(xiàn)了3個(gè) SNP位點(diǎn),第4734位 G→A突變,第4845位 A→G突變,1處插入突變。
6、利用PCR-RFLP和PCR-SSCP技術(shù),對(duì)其中4個(gè)S N P位點(diǎn)在延邊黃牛群體中進(jìn)行了基因分型,并與生產(chǎn)性狀進(jìn)行了關(guān)聯(lián)分析,結(jié)果表明:(1)牛 A C T A1-Avr II-RFLP的不同基因型主要與體長(zhǎng)、胸圍、體重和平均日增重顯著相關(guān);(2) Glutamyl t
8、RNA Synthetase基因 G4734A突變?cè)谥舅岱矫媾c亞油酸和棕櫚油酸存在相關(guān)性,在氨基酸含量方面與甘氨酸、丙氨酸、谷氨酸和組氨酸存在顯著相關(guān)(3)牛 ASB12基因 T712C突變?cè)谥舅岱矫媾c棕櫚油酸和肉豆蔻酸存在相關(guān)性,在氨基酸含量方面與賴(lài)氨酸、天冬氨酸、脯氨酸、亮氨酸和谷氨酸值存在顯著相關(guān);(4)牛 Titin-Msp I-RFLP的不同基因型主要與L*24(亮度)、c*24(彩度)、棕櫚酸、硬脂酸、油酸和肌內(nèi)脂肪含量
9、顯著相關(guān)。
7、利用GeneFishing差異顯示技術(shù),對(duì)延邊黃牛閹牛和公牛背最長(zhǎng)肌差異表達(dá)基因進(jìn)行了篩選。共獲得10條ESTs,通過(guò)NCBI比對(duì)發(fā)現(xiàn)其中8條序列與已知序列高度同源,MYH7、NDUFS8和HSL基因在閹牛肌肉中表達(dá)上調(diào),NADH脫氫酶亞單位6和ACTA1基因在閹牛肌肉中表達(dá)下調(diào),2條為未知新基因。
8、選取其中5個(gè)差異表達(dá)基因NADH脫氫酶亞單位6、MYH7、HSL、NDUFS8和ACTA1基因進(jìn)行
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