延邊黃牛背最長(zhǎng)肌差異表達(dá)基因的克隆鑒定及特征分析.pdf

1、肌內(nèi)脂肪（Intramuscular fat，IMF)是形成牛肉大理石花紋的物質(zhì)基礎(chǔ)，是影響牛肉嫩度和風(fēng)味的一個(gè)主要因素。不同肌內(nèi)脂肪含量的個(gè)體肌肉組織基因的表達(dá)模式存在差異；閹牛與公牛相比，肌內(nèi)脂肪增加，肉的嫩度增加，提高了牛肉等級(jí)。隨著人們對(duì)基因結(jié)構(gòu)和功能的深入研究，這些差異的產(chǎn)生應(yīng)是基因的差異表達(dá)的結(jié)果。因此，本試驗(yàn)以相同月齡、同一飼養(yǎng)條件下的延邊黃牛背最長(zhǎng)肌為材料，利用 GeneFishing差異顯示技術(shù)對(duì)肌內(nèi)脂肪含量差異極顯著

2、的個(gè)體間以及閹牛和公牛背最長(zhǎng)肌進(jìn)行了差異表達(dá)基因的篩選、克隆和鑒定，取得了如下結(jié)果：
　　1、試驗(yàn)選取30頭28月齡延邊黃牛閹牛分別選取肌內(nèi)脂肪含量最高和最低各3個(gè)個(gè)體組成兩組，其平均肌內(nèi)脂肪含量分別為17.58％±0.14%和5.16%±0.32%，組間差異極顯著（P＜0.01）。采用G e n e F i s h i n g技術(shù)，分析了兩組個(gè)體背最長(zhǎng)肌組織差異表達(dá)基因。利用40對(duì)隨機(jī)引物差異顯示擴(kuò)增下，共獲得12條ESTs，通

3、過(guò)NCBI比對(duì)發(fā)現(xiàn)其中8個(gè)為已知的ESTs，這些差異基因主要包括5類(lèi)：細(xì)胞骨架形成相關(guān)基因（Titin，ACTA1），細(xì)胞因子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)基因（ASB12），轉(zhuǎn)錄復(fù)合體相關(guān)基因（RPS14、RPS26和RPLP1），細(xì)胞能量代謝密切相關(guān)基因（COX4），未知功能蛋白Glutamyl tRNA Synthetase基因和4個(gè)未知基因。
　　2、從30頭延邊黃牛閹牛中選取肌內(nèi)脂肪含量最高和最低的9個(gè)個(gè)體組成兩組，肌內(nèi)脂肪含量分別為13

4、.26%±0.28%和4.65%±0.18%（P＜0.05）。通過(guò)RT-PCR和實(shí)時(shí)定量PCR定性和定量檢測(cè)個(gè)體基因表達(dá)水平。熒光定量PCR結(jié)果顯示ASB12和Titin基因mRNA表達(dá)水平與肌內(nèi)脂肪含量呈正相關(guān)關(guān)系；Glutamyl tRNA Synthetase、RPLP1和ACTA1基因mRNA表達(dá)水平與肌內(nèi)脂肪含量呈負(fù)相關(guān)關(guān)系。
　　3、利用半定量 RT-PCR技術(shù)對(duì)所獲得的差異表達(dá)基因進(jìn)行了不同組織（背最長(zhǎng)肌、心臟、肝臟

5、、脾臟、肺臟、腎臟、小腸和瘤胃）間的表達(dá)分析。
　　4、利用ORF Finder、CLUSTALW等軟件對(duì)牛ACTA1、ASB12和 GlutamyltRNA Synthetase基因結(jié)構(gòu)、所編碼的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)、功能、系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)等特征進(jìn)行了預(yù)測(cè)和分析，并進(jìn)行了系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)的構(gòu)建。
　　5、利用比較基因組學(xué)和 PCR技術(shù)，克隆了 ACTA1、Titin、ASB12和GlutamyltRNASynthetase基因的部分基因組序列，

6、并分析了這4個(gè)基因在延邊黃牛群體中的多態(tài)性：（1）ACTA1，1598bp，GenBank登錄號(hào)為HQ608159，在其上發(fā)現(xiàn)了2個(gè) S N P s位點(diǎn)，第193位 A→G突變和第288位A→G突變。（2）Titin發(fā)現(xiàn)了3個(gè) SNP位點(diǎn)，分別為第45003位 A→G突變，第70541位 A→G突變和第70553位 C→A突變。（3）ASB12發(fā)現(xiàn)了3個(gè) SNPs位點(diǎn)，分別為第712位 T→C突變，第886位 G→C突變和第1042位

7、C→T突變。（4）GlutamyltRNASynthetase發(fā)現(xiàn)了3個(gè) SNP位點(diǎn)，第4734位 G→A突變，第4845位 A→G突變，1處插入突變。
　　6、利用PCR-RFLP和PCR-SSCP技術(shù)，對(duì)其中4個(gè)S N P位點(diǎn)在延邊黃牛群體中進(jìn)行了基因分型，并與生產(chǎn)性狀進(jìn)行了關(guān)聯(lián)分析，結(jié)果表明：（1）牛 A C T A1-Avr II-RFLP的不同基因型主要與體長(zhǎng)、胸圍、體重和平均日增重顯著相關(guān)；（2） Glutamyl t

8、RNA Synthetase基因 G4734A突變?cè)谥舅岱矫媾c亞油酸和棕櫚油酸存在相關(guān)性，在氨基酸含量方面與甘氨酸、丙氨酸、谷氨酸和組氨酸存在顯著相關(guān)（3）牛 ASB12基因 T712C突變?cè)谥舅岱矫媾c棕櫚油酸和肉豆蔻酸存在相關(guān)性，在氨基酸含量方面與賴(lài)氨酸、天冬氨酸、脯氨酸、亮氨酸和谷氨酸值存在顯著相關(guān)；（4）牛 Titin-Msp I-RFLP的不同基因型主要與L*24（亮度）、c*24（彩度）、棕櫚酸、硬脂酸、油酸和肌內(nèi)脂肪含量

9、顯著相關(guān)。
　　7、利用GeneFishing差異顯示技術(shù)，對(duì)延邊黃牛閹牛和公牛背最長(zhǎng)肌差異表達(dá)基因進(jìn)行了篩選。共獲得10條ESTs，通過(guò)NCBI比對(duì)發(fā)現(xiàn)其中8條序列與已知序列高度同源，MYH7、NDUFS8和HSL基因在閹牛肌肉中表達(dá)上調(diào)，NADH脫氫酶亞單位6和ACTA1基因在閹牛肌肉中表達(dá)下調(diào)，2條為未知新基因。
　　8、選取其中5個(gè)差異表達(dá)基因NADH脫氫酶亞單位6、MYH7、HSL、NDUFS8和ACTA1基因進(jìn)行