茶樹(shù)花蕾發(fā)育差異表達(dá)基因克隆與分析.pdf

1、茶樹(shù)是我國(guó)的一種重要的經(jīng)濟(jì)作物，是常綠葉用異花授粉植物。在種植上，為了收獲鮮葉，茶樹(shù)的樹(shù)叢的高度一般保持在10-100厘米，這個(gè)過(guò)程一般可以持續(xù)上百年，茶樹(shù)鮮葉的產(chǎn)量直接影響到該產(chǎn)業(yè)的經(jīng)濟(jì)效益。茶樹(shù)種植一般3-5年后每年都要開(kāi)花結(jié)實(shí)，直到植株死亡每年進(jìn)行。在自然授粉條件下，大多數(shù)茶樹(shù)的開(kāi)花率都比較高，可是結(jié)實(shí)率品種之間卻有很大的區(qū)別。茶樹(shù)從花芽形成到種子成熟，共經(jīng)過(guò)約一年半左右的時(shí)間，而且從6月到12月的6個(gè)月時(shí)間中，一方面是當(dāng)年的茶花

2、孕蕾開(kāi)花和授粉，另一方面是上一年受精的茶花發(fā)育形成種子并成熟的過(guò)程，兩年的花果同時(shí)發(fā)育生長(zhǎng)，都是大量消耗養(yǎng)分的生理和生長(zhǎng)活動(dòng)過(guò)程。花果的生長(zhǎng)和發(fā)育對(duì)茶樹(shù)養(yǎng)分的供應(yīng)的要求很高，往往會(huì)抑制營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)，新梢不能發(fā)育，導(dǎo)致茶樹(shù)鮮葉產(chǎn)量減少。因此，怎么有效地控制茶樹(shù)生殖生長(zhǎng)，加強(qiáng)茶樹(shù)的營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)成為茶樹(shù)育種的一個(gè)關(guān)鍵問(wèn)題。 由于茶樹(shù)是多年生異花授粉的木本植物，品種選育和基礎(chǔ)遺傳研究難度大。早在二十世紀(jì)初，就有茶樹(shù)育種專(zhuān)家想通過(guò)自交的方式獲得茶

3、樹(shù)的純種，但是沒(méi)有成功。所以目前在茶葉生產(chǎn)上茶樹(shù)的繁殖推廣多采用短穗扦插的無(wú)性繁殖方式進(jìn)行，有利于優(yōu)良性狀的穩(wěn)定遺傳。茶葉生產(chǎn)上不提倡用種子繁殖，主要是有性繁殖的后代出現(xiàn)性狀分離現(xiàn)象，因而不能象其他作物那樣利用基因型相同的雜種一代。近年來(lái)有關(guān)茶樹(shù)品質(zhì)及次生代謝產(chǎn)物的研究進(jìn)展較快，但是有關(guān)茶樹(shù)生殖生物學(xué)的研究進(jìn)行得還不是很多。 茶樹(shù)的開(kāi)花，是一個(gè)連續(xù)的過(guò)程，它意味著不同的發(fā)育階段，包括花芽分化、始花、成花、盛花期都有可能在同一棵植

4、株上同時(shí)發(fā)生。所有這些過(guò)程都是連續(xù)不間斷的，所以很難被獨(dú)立的分析。目前，有關(guān)茶樹(shù)代謝組學(xué)功能基因研究進(jìn)展較快，但是對(duì)茶樹(shù)的發(fā)育的研究進(jìn)行得非常少。至于茶樹(shù)花發(fā)育性狀分子生物學(xué)方面的研究，國(guó)內(nèi)外還沒(méi)有報(bào)道。 本研究以茶樹(shù)結(jié)實(shí)率差異顯著的兩個(gè)品種龍井43和烏龍為材料，利用cDNA-AFLP技術(shù)，從分子水平上，對(duì)茶樹(shù)花蕾發(fā)育過(guò)程中基因表達(dá)的時(shí)空特異性進(jìn)行了研究，試圖通過(guò)分離茶樹(shù)花發(fā)育相關(guān)基因，獲得某些與茶樹(shù)生殖發(fā)育機(jī)理得相關(guān)線索，從分

5、子生物學(xué)水平上研究茶樹(shù)發(fā)育性狀。通過(guò)研究取得了如下結(jié)果： (1)對(duì)cDNA-AFLP技術(shù)體系進(jìn)行了優(yōu)化，結(jié)果表明：cDNA-AFLP預(yù)擴(kuò)增適宜退火溫度為53℃，擴(kuò)增循環(huán)次數(shù)為20個(gè)循環(huán)，預(yù)擴(kuò)增和選擇性擴(kuò)增PCR體系中Mg2+濃度均為2.3mM。對(duì)茶樹(shù)兩個(gè)品種的不同發(fā)育階段的花蕾進(jìn)行共64對(duì)引物組合的cDNA-AFLP分析，高結(jié)實(shí)率和低結(jié)實(shí)率兩個(gè)品種的花蕾之間表達(dá)存在差異，同一品種花蕾發(fā)育不同時(shí)期基因表達(dá)存在差異。 (2)

6、利用E11M11引物對(duì)茶樹(shù)兩個(gè)品種花蕾發(fā)育不同時(shí)期表達(dá)差異進(jìn)行cDNA-AFLP分析，在兩個(gè)品種的大花蕾中同時(shí)發(fā)現(xiàn)一條特異表達(dá)條帶(ChaH-1)。RT-PCR證明該基因只在茶樹(shù)兩個(gè)品種的大花蕾中特異表達(dá)。利用RACE技術(shù)得到該基因cDNA全長(zhǎng)，全長(zhǎng)為1537bp，命名為T(mén)ua1。經(jīng)BLAST查詢對(duì)比，該基因堿基序列與擬南芥中的α-微管蛋白基因有87％的相似性。Tua1的ORF從第6號(hào)堿基開(kāi)始，第1535號(hào)堿基終止，1350個(gè)堿基編碼4

7、50個(gè)氨基酸。 (3)通過(guò)RT-PCR法擴(kuò)增出Tua1基因cDNA編碼區(qū)全序列，并將其克隆到表達(dá)()體pET-32a(+)中，在表達(dá)宿主菌BL21trxB(DE3)中高效表達(dá)，產(chǎn)生分子量約為69kDa的融合蛋白，該融合蛋白包括112個(gè)氨基酸殘基的硫氧還原蛋白及450個(gè)氨基酸殘基的Tua1蛋白。隨著誘導(dǎo)時(shí)間的延長(zhǎng)，表達(dá)的融合蛋白產(chǎn)量逐漸增加，表達(dá)蛋白總量最高可達(dá)到菌體總蛋白的34.24％；在菌體的各個(gè)部位中，融合蛋白主要在細(xì)胞質(zhì)中