閹牛、公牛背最長肌消減cDNA文庫的構建和差異表達基因的篩選與鑒定.pdf

1、骨骼肌是動物體內最豐富的組織，其生長發(fā)育是肉用家畜最重要的經濟性狀之一。經去勢后的閹牛與公牛相比，生長速度減緩，體脂累積加速，肌內脂肪增加，肉的嫩度增加，提高了牛肉等級。隨著人們對基因結構和功能的研究深入，人們認識到這些差異應是基因差異表達的結果。為進一步揭示不同類型個體間基因的表達規(guī)律，本研究選取了相同月齡、同一飼養(yǎng)條件下的3頭中國西門塔爾牛閹牛和3頭中國西門塔爾牛公牛，以背最長肌為材料，利用抑制消減雜交技術構建了閹牛和公牛背最長肌間

2、的消減cDNA文庫，進行了差異表達基因的篩選，并結合定量PCR和生物信息學方法進行鑒定，取得了如下結果： 1.飼養(yǎng)和屠宰實驗表明，育肥后公牛體尺、胴體性狀均高于閹牛，其中體斜長、出欄重、屠宰重、胴體深、胴體重，臀肉、前腿肉、差異顯著(P＜0.05)；里脊、上腦差異極顯著(P＜0.01)。肉質性狀分析表明，公牛眼肌面積、大理石花紋評分、Zn含量高于閹牛，差異顯著(P＜0.05)；而脂肪顏色、背膘厚、水分、Ca含量閹牛高于公牛，且差

3、異顯著(P＜0.05)。 2.以管家基因β-actin作為消減指標，對消減文庫的消減效率進行了檢測，結果表明消減文庫的消減效率達25倍以上，這同時也表明了某些特異于兩種肌肉組織的差異表達基因的富集效率也達25倍以上，表明所構建的消減cDNA文庫質量很好。 3.從以閹牛為Tester、公牛為Driver的消減cDNA文庫中隨機挑取了300多個克隆。利用PCR技術進行鑒定，獲得了223個有效陽性克隆，插入片段長度主要分布于1

4、50～700bp之間。 4.分別利用閹牛、公牛背最長肌cDNA作探針對消減cDNA文庫中的陽性克隆進行了篩選。選取了84個差異表達克隆進行分析，發(fā)現(xiàn)共代表10個ESTs，在牛中均為已知基因。 5.選取其中4個差異表達基因ACTG2、TPM2、IGF-1、HSL進行定量PCR的驗證和組織表達特征檢測，結果表明均為差異表達，且在肌肉、肝臟和脂肪組織中呈現(xiàn)表達量的差異趨同性，這些基因的表達特異性可能與其在閹牛和公牛骨骼肌發(fā)育中