閹牛、公牛背最長肌消減cDNA文庫的構(gòu)建和差異表達(dá)基因的篩選與鑒定.pdf

1、骨骼肌是動物體內(nèi)最豐富的組織，其生長發(fā)育是肉用家畜最重要的經(jīng)濟(jì)性狀之一。經(jīng)去勢后的閹牛與公牛相比，生長速度減緩，體脂累積加速，肌內(nèi)脂肪增加，肉的嫩度增加，提高了牛肉等級。隨著人們對基因結(jié)構(gòu)和功能的研究深入，人們認(rèn)識到這些差異應(yīng)是基因差異表達(dá)的結(jié)果。為進(jìn)一步揭示不同類型個體間基因的表達(dá)規(guī)律，本研究選取了相同月齡、同一飼養(yǎng)條件下的3頭中國西門塔爾牛閹牛和3頭中國西門塔爾牛公牛，以背最長肌為材料，利用抑制消減雜交技術(shù)構(gòu)建了閹牛和公牛背最長肌間

2、的消減cDNA文庫，進(jìn)行了差異表達(dá)基因的篩選，并結(jié)合定量PCR和生物信息學(xué)方法進(jìn)行鑒定，取得了如下結(jié)果： 1.飼養(yǎng)和屠宰實(shí)驗(yàn)表明，育肥后公牛體尺、胴體性狀均高于閹牛，其中體斜長、出欄重、屠宰重、胴體深、胴體重，臀肉、前腿肉、差異顯著(P＜0.05)；里脊、上腦差異極顯著(P＜0.01)。肉質(zhì)性狀分析表明，公牛眼肌面積、大理石花紋評分、Zn含量高于閹牛，差異顯著(P＜0.05)；而脂肪顏色、背膘厚、水分、Ca含量閹牛高于公牛，且差

3、異顯著(P＜0.05)。 2.以管家基因β-actin作為消減指標(biāo)，對消減文庫的消減效率進(jìn)行了檢測，結(jié)果表明消減文庫的消減效率達(dá)25倍以上，這同時(shí)也表明了某些特異于兩種肌肉組織的差異表達(dá)基因的富集效率也達(dá)25倍以上，表明所構(gòu)建的消減cDNA文庫質(zhì)量很好。 3.從以閹牛為Tester、公牛為Driver的消減cDNA文庫中隨機(jī)挑取了300多個克隆。利用PCR技術(shù)進(jìn)行鑒定，獲得了223個有效陽性克隆，插入片段長度主要分布于1

4、50～700bp之間。 4.分別利用閹牛、公牛背最長肌cDNA作探針對消減cDNA文庫中的陽性克隆進(jìn)行了篩選。選取了84個差異表達(dá)克隆進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)共代表10個ESTs，在牛中均為已知基因。 5.選取其中4個差異表達(dá)基因ACTG2、TPM2、IGF-1、HSL進(jìn)行定量PCR的驗(yàn)證和組織表達(dá)特征檢測，結(jié)果表明均為差異表達(dá)，且在肌肉、肝臟和脂肪組織中呈現(xiàn)表達(dá)量的差異趨同性，這些基因的表達(dá)特異性可能與其在閹牛和公牛骨骼肌發(fā)育中