γ射線(xiàn)致人淋巴母細(xì)胞及其旁效應(yīng)細(xì)胞FHIT、PTEN表達(dá)變化及分子機(jī)制的研究.pdf

1、隨著核能在國(guó)民經(jīng)濟(jì)和軍事領(lǐng)域中的應(yīng)用越來(lái)越廣泛,電離輻射對(duì)人類(lèi)潛在的危害也不斷增加。一般認(rèn)為輻射造成細(xì)胞核DNA分子嚴(yán)重?fù)p傷,使某些受照體細(xì)胞中特定的基因或染色體發(fā)生突變,其中涉及到原癌基因的激活和抑癌基因的失活或突變、DNA錯(cuò)配損傷修復(fù)反應(yīng)、細(xì)胞增殖失控及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的改變等因素的綜合作用。其機(jī)制的研究是電離輻射生物學(xué)效應(yīng)研究的熱點(diǎn)和難點(diǎn)之一。值得關(guān)注的是,自從國(guó)外學(xué)者提出電離輻射旁效應(yīng)概念以來(lái),許多研究者證實(shí)旁效應(yīng)的存在,對(duì)“照射細(xì)

2、胞核才會(huì)引起細(xì)胞致命的損傷”“只有受照射細(xì)胞才受到損傷”等某些傳統(tǒng)觀念提出了有力的挑戰(zhàn),輻射誘導(dǎo)的基因不穩(wěn)定性、細(xì)胞質(zhì)受到照射所致的突變及旁效應(yīng)等在輻射致癌中同樣具有重要作用,并得到放射生物學(xué)界的確認(rèn)。雖然電離輻射旁效應(yīng)的機(jī)制遠(yuǎn)未了解,但旁效應(yīng)的發(fā)現(xiàn)和研究對(duì)于低劑量放射生物效應(yīng)本質(zhì)的深入理解及揭示輻射致癌分子機(jī)制具有重要的理論意義和實(shí)際價(jià)值。 輻射誘導(dǎo)旁效應(yīng)是指未直接受照射細(xì)胞表現(xiàn)出與受照射細(xì)胞類(lèi)似的生物學(xué)反應(yīng)。國(guó)內(nèi)外關(guān)于旁效應(yīng)

3、的研究主要集中在兩方面：第一是效應(yīng)研究,包括細(xì)胞凋亡或延遲死亡、基因不穩(wěn)定性、突變、基因表達(dá)改變、炎癥反應(yīng)、微核形成以及細(xì)胞生長(zhǎng)異常等。第二是旁效應(yīng)機(jī)制研究?，F(xiàn)有的資料表明旁效應(yīng)機(jī)制是： (1)活性氧作用：用α粒子照射正常人成纖維細(xì)胞,發(fā)現(xiàn)細(xì)胞間O2-、H2O2的產(chǎn)生,并發(fā)現(xiàn)膜上還原酶Ⅱ氧化酶在細(xì)胞間ROS增高起重要作用。如用抗氧化劑DMSO處理細(xì)胞,發(fā)現(xiàn)SCE突變量明顯降低。由此可見(jiàn),電離輻射旁效應(yīng)引起細(xì)胞損傷機(jī)制至少部分間接

4、地與ROS有關(guān)。 (2)細(xì)胞因子作用：實(shí)驗(yàn)證實(shí),低劑量α粒子照射人成纖維細(xì)胞的培養(yǎng)基,引起未照射細(xì)胞的增殖,并引起照射細(xì)胞的上清液中SOD和TGF-β1的濃度增加。另一實(shí)驗(yàn)證實(shí),IL-8作為一種信號(hào)分子在輻射旁效應(yīng)中起重要作用。除此之外,線(xiàn)粒體在氧化應(yīng)激時(shí)分泌的凋亡誘導(dǎo)因子(AIF)也可能與電離輻射旁效應(yīng)有關(guān)系。 (3)細(xì)胞間縫隙連接通訊：研究者認(rèn)為,照射細(xì)胞數(shù)量(細(xì)胞密度)是輻射旁效應(yīng)的主要相關(guān)參數(shù)?？赡苡捎诩?xì)胞密度大

5、,細(xì)胞縫隙連接通訊發(fā)生作用,使許多物質(zhì)釋放到培養(yǎng)基而發(fā)生旁效應(yīng)。另外,電離輻射旁效應(yīng)的細(xì)胞間信號(hào)傳遞涉及到能量代謝,其中ATP產(chǎn)生或NAD/NADP減少,可能是輻射旁效應(yīng)發(fā)生的關(guān)鍵。值得注意的是：對(duì)于哪類(lèi)基因在輻射產(chǎn)生的旁效應(yīng)中起作用直到目前,輻射旁效應(yīng)及其機(jī)制遠(yuǎn)未了解。脆性組氨酸三聯(lián)體(FHIT)基因是1996年Ohta等用差異顯示分析探針和外顯子捕獲法在染色體3p14.2區(qū)域新發(fā)現(xiàn)的抑癌基因,全長(zhǎng)約1Mb。其cDNA長(zhǎng)1095bp,

6、由10個(gè)外顯子組成,其5'端含有一段長(zhǎng)約350bp的非編碼區(qū),包含外顯子1～3;外顯子5～9組成一長(zhǎng)約500bp的開(kāi)放性閱讀框架,編碼一個(gè)由147個(gè)氨基酸組成的相對(duì)分子質(zhì)量為16.8×103D的蛋白質(zhì)。FHIT在生物機(jī)體內(nèi)起廣泛的作用,包括:①調(diào)控細(xì)胞周期,②誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡,③FHIT蛋白水解酶活性,④促進(jìn)微管組裝。 10號(hào)染色體缺失的磷酸酶及張力蛋白同源物(PTEN)是迄今發(fā)現(xiàn)的第一個(gè)具有雙特異性磷酸酶活性的抑癌基因,定位在染色

7、體10q23.3上,有9個(gè)外顯子,編碼由403個(gè)氨基酸組成的蛋白。PTEN與腫瘤的惡性增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移等生物學(xué)特性密切相關(guān),在生物機(jī)體內(nèi)起廣泛的作用,包括:①調(diào)控細(xì)胞周期,②誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡,③調(diào)節(jié)細(xì)胞粘連、遷移和分化。 本研究從細(xì)胞、基因和蛋白水平對(duì)電離輻射細(xì)胞及其旁效應(yīng)細(xì)胞FHIT、PTEN表達(dá)變化及分子機(jī)制進(jìn)行了初步研究。 研究?jī)?nèi)容: 1.60Coγ射線(xiàn)照射人淋巴細(xì)胞(AHH-1)及與其細(xì)胞和培養(yǎng)液共同培養(yǎng)未照

8、射細(xì)胞增殖能力的變化、細(xì)胞周期的改變和早期凋亡的情況。 2.60Coγ射線(xiàn)致AHH-1細(xì)胞及與其細(xì)胞和培養(yǎng)液共同培養(yǎng)未照射細(xì)胞不同時(shí)間點(diǎn)FHIT、PTENmRNA及蛋白表達(dá)變化的研究。 3.氧自由基清除劑二甲基亞砜(DMSO)預(yù)處理后,不同劑量60Coγ射線(xiàn)致AHH-1細(xì)胞及與其細(xì)胞和培養(yǎng)液共同培養(yǎng)未照射細(xì)胞在不同時(shí)間點(diǎn)FHIT、PTEN蛋白表達(dá)變化,以及對(duì)細(xì)胞增殖、細(xì)胞早期凋亡和周期的影響。 實(shí)驗(yàn)方法:

9、 1.旁效應(yīng)細(xì)胞模型的制備：正常人淋巴細(xì)胞(AHH-1)經(jīng)0.5、2和5Gy60Coγ射線(xiàn)照射后立即離心,將直接受照細(xì)胞與未受照細(xì)胞按1:1比例在Transwell中共同培養(yǎng),另將離心后未過(guò)濾的受照細(xì)胞培養(yǎng)液與未受照細(xì)胞在25cm2培養(yǎng)瓶中共同培養(yǎng),未經(jīng)照射組設(shè)為對(duì)照,細(xì)胞處理好后,在37℃、5％CO2條件下細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。 2.應(yīng)用細(xì)胞計(jì)數(shù)法觀察未受照細(xì)胞、受照細(xì)胞和旁效應(yīng)細(xì)胞增殖變化,流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組細(xì)胞早期凋亡和周期變

10、化。 3.應(yīng)用RT-PCR、Western Blot方法檢測(cè)未受照細(xì)胞、受照細(xì)胞和旁效應(yīng)細(xì)胞在照后即刻、6、12、24h抑癌基因FHIT、PTENmRNA及蛋白水平表達(dá)情況。 4.AHH-1細(xì)胞經(jīng)氧自由基清除劑二甲基亞砜(DMSO)預(yù)處理后,按1步驟制備旁效應(yīng)細(xì)胞模型,重復(fù)2、3實(shí)驗(yàn),觀察細(xì)胞經(jīng)DMSO預(yù)處理前后FHIT、PTEN蛋白水平表達(dá)情況,以及細(xì)胞增殖、凋亡和周期變化情況。 5.統(tǒng)計(jì)學(xué)方法：?jiǎn)螛颖総檢驗(yàn)、

11、單因素方差分析。 結(jié)果: 1.直接受照細(xì)胞在照射后出現(xiàn)細(xì)胞增殖能力下降,早期凋亡增加,細(xì)胞增殖出現(xiàn)G2期阻滯,各組旁效應(yīng)細(xì)胞也出現(xiàn)相同的現(xiàn)象,且旁效應(yīng)細(xì)胞早期凋亡與照射劑量無(wú)明顯相關(guān)性。 2.與對(duì)照組比較,直接受照及旁效應(yīng)細(xì)胞FHIT mRNA表達(dá)呈下降,但變化不顯著；直接受照及旁效應(yīng)細(xì)胞FHIT蛋白表達(dá)均呈下降趨勢(shì),吸收劑量為0.5Gy時(shí),其變化不顯著；隨劑量的增加,FHIT蛋白表達(dá)下降越顯著,尤其是照射劑量達(dá)

12、2.0Gy以上時(shí),FHIT蛋白表達(dá)顯著下降,存在比較明顯的劑量依賴(lài)性。直接受照細(xì)胞在照射后24小時(shí)下調(diào)幅度最大,旁效應(yīng)細(xì)胞在照射后12小時(shí)下調(diào)幅度最大。 3.直接受照及旁效應(yīng)細(xì)胞PTEN mRNA表達(dá)呈下降趨勢(shì),但變化不顯著。PTEN蛋白表達(dá)下調(diào)程度與細(xì)胞的處理方式有關(guān),以受照細(xì)胞培養(yǎng)液培養(yǎng)的旁效應(yīng)細(xì)胞表達(dá)下調(diào)最為顯著,且高于直接受照細(xì)胞。但在處理后12h檢測(cè)其蛋白表達(dá)情況,發(fā)現(xiàn)受照細(xì)胞共同培養(yǎng)組中0.5Gy旁效應(yīng)細(xì)胞較2Gy旁

13、效應(yīng)細(xì)胞下調(diào)明顯,與照射劑量無(wú)關(guān)。該結(jié)果目前未見(jiàn)報(bào)道。 4.經(jīng)氧自由基清除劑二甲基亞砜(DMSO)預(yù)處理后,受照細(xì)胞、受照細(xì)胞共培養(yǎng)細(xì)胞、受照細(xì)胞培養(yǎng)液處理細(xì)胞較未處理細(xì)胞比較,各組細(xì)胞PTEN、FHIT蛋白表達(dá)均有所上調(diào),且早期凋亡及G2期阻滯情況也有所改變。 結(jié)論: 1.受照細(xì)胞共培養(yǎng)細(xì)胞和受照細(xì)胞培養(yǎng)液處理細(xì)胞均出現(xiàn)與直接受照細(xì)胞相同的增殖能力下降現(xiàn)象,且下降幅度與照射劑量相關(guān)及處理?xiàng)l件有關(guān)。 2.

14、受照細(xì)胞、受照細(xì)胞共培養(yǎng)細(xì)胞和受照細(xì)胞培養(yǎng)液處理細(xì)胞在處理后24h,細(xì)胞早期凋亡均出現(xiàn)增加,直接受照細(xì)胞早期凋亡率與照射劑量存在明顯的相關(guān)性,而旁效應(yīng)細(xì)胞凋亡率與照射劑量相關(guān)不顯著。 3.旁效應(yīng)細(xì)胞組與直接受照細(xì)胞組均出現(xiàn)G2期阻滯現(xiàn)象。 4.直接受照及旁效應(yīng)細(xì)胞FHIT mRNA表達(dá)呈下降趨勢(shì),但改變不顯著,較高劑量(2.0-5.0Gy)60Coγ射線(xiàn)能導(dǎo)致直接受照細(xì)胞FHIT蛋白表達(dá)顯著下調(diào),且存在劑量依賴(lài)關(guān)系,照射

15、劑量越大,其下調(diào)越顯著。旁效應(yīng)細(xì)胞FHIT蛋白表達(dá)表現(xiàn)出與直接照射細(xì)胞一致的變化趨勢(shì),蛋白下調(diào)水平幅度在細(xì)胞處理后12h最為明顯,且受照細(xì)胞共培養(yǎng)組下降幅度高于直接照射細(xì)胞。該結(jié)果目前未見(jiàn)報(bào)道。 5.直接受照及旁效應(yīng)細(xì)胞PTEN mRNA表達(dá)呈下降趨勢(shì),但改變不顯著,不同劑量受照細(xì)胞PTEN蛋白表達(dá)呈下調(diào)趨勢(shì),且存在劑量依賴(lài)關(guān)系,照射劑量越大,其下調(diào)越顯著。不同劑量旁效應(yīng)細(xì)胞PTEN蛋白表達(dá)也表現(xiàn)出下調(diào)趨勢(shì),在細(xì)胞處理后12h最

16、為明顯,下調(diào)程度與細(xì)胞的處理方式有關(guān),以受照細(xì)胞培養(yǎng)液培養(yǎng)的旁效應(yīng)細(xì)胞表達(dá)下調(diào)最為顯著,但受照細(xì)胞共同培養(yǎng)組中0.5Gy旁效應(yīng)細(xì)胞較2Gy旁效應(yīng)細(xì)胞下調(diào)明顯,分析抑癌基因PTEN在低劑量(0.5Gy)照射時(shí)較敏感。該結(jié)果目前未見(jiàn)報(bào)道。 6.AHH-1細(xì)胞經(jīng)氧自由基清除劑DMSO處理后,再經(jīng)上述條件處理,并與上述結(jié)果比較,分析氧自由基清除劑對(duì)受照細(xì)胞有一定的保護(hù)作用,可以使抑癌基因FTEN、PTEN受損減少,使其維持正常生理功能,