PARP-1-P53信號通路在氫醌誘導(dǎo)人淋巴母細(xì)胞凋亡中的作用及其可能機(jī)制.pdf

1、[目的]：
　　1.利用慢病毒介導(dǎo)的RNA干擾技術(shù)構(gòu)建人類淋巴母細(xì)胞（簡稱TK6細(xì)胞）的PARP-1基因沉默穩(wěn)定細(xì)胞株（簡稱TK6-shPARP1細(xì)胞），作為后續(xù)研究的工具細(xì)胞;
　　2.闡明PARP-1/P53信號通路在氫醌(Hydroquinone，HQ)誘導(dǎo)人淋巴母細(xì)胞凋亡中的作用及其可能機(jī)制。
　　[方法]：
　　1.應(yīng)用RNA干擾技術(shù)構(gòu)建PARP-1基因沉默細(xì)胞株:利用瞬時(shí)轉(zhuǎn)染方法篩選出具有最佳干擾效果

2、的shRNA片段，將該片段與慢病毒載體pLVX-shRNA1連接形成重組質(zhì)粒，經(jīng)DNA測序鑒定后進(jìn)行病毒包裝，隨后轉(zhuǎn)導(dǎo)至TK6細(xì)胞中，再經(jīng)嘌呤霉素篩選而得到穩(wěn)定表達(dá)PARP-1 siRNA的PARP-1基因沉默細(xì)胞株，最后用qPCR和Western blotting鑒定所構(gòu)建的細(xì)胞株。
　　2.細(xì)胞凋亡檢測:利用Hoechst33342染色試劑定性觀察細(xì)胞凋亡情況;再用Caspase-3酶活性檢測試劑盒定量檢測Caspase-3酶

3、活性的改變情況。
　　3.應(yīng)用Western blotting技術(shù)檢測P53信號通路相關(guān)蛋白:
　　在不同濃度HQ作用于人淋巴母細(xì)胞TK6細(xì)胞后PARP-1、SIRT-1、P53、Caspase-3、Bcl-2、Fas、K-ras蛋白的表達(dá)情況;在不同濃度HQ作用于TK6-shPARP1細(xì)胞后SIRT-1、P53、Caspase-3、Bcl-2、Fas、K-ras蛋白的表達(dá)情況。
　　[結(jié)果]：
　　1.成功構(gòu)建

4、PARP-1基因沉默細(xì)胞株:轉(zhuǎn)染shRNA1、shRNA2、shRNA3、shRNA4細(xì)胞的PARP-1相對表達(dá)量分別為0.289、0.538、0.375和0.474，故選擇shRNA1作為干擾PARP-1基因最佳片段。用0.5μg/ml的嘌呤霉素成功篩選出PARP-1沉默細(xì)胞株和空載體對照細(xì)胞株，并從mRNA水平、蛋白質(zhì)水平、細(xì)胞表型水平三個(gè)層次來檢測PARP-1基因的干擾效率，抑制效率超過80％。
　　2.HQ染毒對細(xì)胞凋亡影

5、響:Hoechst33342染色顯示在TK6正常細(xì)胞中，隨著HQ濃度的增加，凋亡小體的數(shù)量明顯增加，而在TK6-shPARP1細(xì)胞中凋亡小體的數(shù)量呈現(xiàn)先增后減的趨勢;Caspase-3酶活性檢測顯示在TK6正常細(xì)胞中，隨著HQ濃度的增加，Caspase-3酶活性逐漸升高，而在TK6-shPARP1細(xì)胞中Caspase-3酶活性呈現(xiàn)先增后減的趨勢。
　　3.蛋白表達(dá)水平的改變情況:
　　TK6正常細(xì)胞中，隨著HQ濃度的增加，P

6、ARP-1、P53、Caspase-3、Bcl-2、Fas、K-ras蛋白表達(dá)水平逐漸升高，SIRT-1蛋白表達(dá)水平逐漸降低;TK6-shPARP1細(xì)胞中，隨著HQ濃度的增加，SIRT-1、Caspase-3、Bcl-2、Fas蛋白表達(dá)水平呈現(xiàn)先增后減的趨勢，P53、K-ras蛋白表達(dá)水平逐漸升高。
　　[結(jié)論]：
　　1.成功構(gòu)建PARP-1的siRNA慢病毒干擾載體，并篩選出PARP-1基因沉默的TK6細(xì)胞株，攜帶shR