牛羊大腸桿菌K99-STⅠ雙價保護性抗原基因工程菌株的構建及免疫原性研究.pdf

1、論述了包涵體粗提物蜂腔疫苗、工程菌全菌體蜂膠苗、工程菌全菌體滅活苗的構建及免疫原性實驗，全文主要內容如下： 1．采用PCR技術，擴增出0.54kb的K99(F5)菌毛抗原基因，將其克隆到pUCm-T載體上，酶切鑒定成功構建重組質粒pUCm-K99；人工合成的、耐熱腸毒素ST I基因片段和重組質粒,PUCm--K99，經(jīng)酶切(BamH I+Sal I)、回收、連接，將ST I基因片段插入K99菌毛抗原基因的下游，經(jīng)酶切和PCR方法

2、鑒定，獲得陽性重組質粒pUCm-K99-ST，經(jīng)過測序分初證明完成K99-ST融合基因的構建。 2．重組質粒pUCm-K99-ST經(jīng)EcoR I+Sa/I消化，獲得K99-ST基因片段。將該片段分別插人表達載體．pGEX-4T-1及pET-30a中，篩選陽性重組質粒分別命名為pGEX-K99-ST和pET-K99-ST。將重組質粒pGEX-K99-ST和pET-K99-ST分別轉入大腸桿菌BL21(DE3)中，摸索最洼誘導條件(

3、37℃，IPTG0.4mM/l，220r/min誘導4h)，SDS電泳分析，pGEX-K99-ST表達童相對較低，約為10％左右；而pET-K99-ST表達量較高約為25％以上；融合蛋白經(jīng)回收、復性處理后，瓊擴實驗結果表明，K99-ST融合基因在工程菌BL21中獲得表達，并具有與K99抗體結合的活性。 3．通過反向間接血凝技術，檢測融合蛋白復性后的抗原滴度可以達到1：40。純化融合蛋白后，使用弗氏佐劑對其進行包裹并免疫家兔(1d

4、，14d，21d)，免疫劑量(抗原滴度是1：40為0.5mL/只，Western-blot證實融畬蛋白具有良好的免疫原性。根據(jù)專利ZL8910687 6配制相應疫苗(包涵體粗提物蜂腔疫苗、工程菌全菌體蜂膠苗、工程菌全菌體滅活苗)，使用小白鼠進行安全性試驗和動物攻擊試驗，試驗證實安全性良好，保護率較高。上述三種疫苗免疫家兔后采集抗血清，與處理后的強毒株上清溫育時1-3日齡的乳鼠進行毒素中和試驗，試驗證實抗血清足以中和強毒株的STI腸毒素。