丙型肝炎病毒多表位抗原基因pcx3的構(gòu)建、表達(dá)及免疫原性研究.pdf

1、丙型肝炎病毒(HCV)為單股正鏈RNA病毒，其基因組編碼約3010～3033aa的蛋白前體，從N-端起依次為核心蛋白(C)、包膜蛋白(E)、非結(jié)構(gòu)蛋白NS1-NS5B。HCV具有高度的變異性，能夠迅速突變逃逸宿主的免疫系統(tǒng)。因此，給疫苗的研究帶來許多的困難。近年來的研究提示理想的HCV疫苗必須能夠誘發(fā)高水平、廣譜而特異的體液免疫應(yīng)答和細(xì)胞免疫應(yīng)答。 針對HCV的高度變異性及免疫特點(diǎn)，在HCV基因產(chǎn)物中優(yōu)選了5個具有良好免疫原性的

2、高度保守B/T細(xì)胞表位，組合成一個多表位抗原基因pcx，這些表位分別來自核心蛋白(1～16aa，132～141aa)，E1(126～135aa)，NS3(139～147aa)及NS5B(768～775aa)，以及破傷風(fēng)毒素的T細(xì)胞表位用以增強(qiáng)T細(xì)胞免疫。前期的研究表明與β-半乳糖苷酶融合表達(dá)的多表位抗原PCX具有良好的HCV免疫特異性。 pcx基因經(jīng)過串聯(lián)重復(fù)之后，構(gòu)建成多表位抗原基因pcx3，與6×His-tag融合后，在E.

3、coli宿主中獲得高效表達(dá)。利用C端融合的6×His-tag經(jīng)過Ni2+-NTA-agarose親和層析柱純化后，得到高純度的目的蛋白。利用BCA法對蛋白質(zhì)進(jìn)行定量。 Westernblot結(jié)果顯示原核或真核表達(dá)的PCX3抗原均能被HCV患者陽性血清所識別，表明多表位抗原具有能被HCV抗體特異性識別的表位。ELISA結(jié)果顯示來自不同地區(qū)的不同患者血清中抗-HCV抗體能與PCX3抗原特異反應(yīng)，62份陽性血清中PCX3抗原檢測的檢出

4、率為83.8﹪，提示PCX3抗原的B細(xì)胞表位能被HCV抗體廣泛識別。而PCX抗原的檢出率為70﹪，表明經(jīng)過串聯(lián)重復(fù)后的抗原與HCV抗體的反應(yīng)更強(qiáng)，顯示出良好的免疫原性。 純化的PCX3蛋白與完全弗氏佐劑一起免疫BALB/c小鼠后，能夠誘發(fā)高滴度的特異性IgG(1×106)，并持續(xù)保持?jǐn)?shù)月。不同劑量組進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)50μg的劑量能夠誘發(fā)理想的體液免疫反應(yīng)。另外，利用PCX免疫小鼠的特異性抗體滴度最高達(dá)1×104，這一結(jié)果表明，與P

5、CX抗原相比，串聯(lián)重復(fù)的PCX3抗原能夠誘發(fā)更強(qiáng)的免疫反應(yīng)?？筆CX3抗血清與多肽的反應(yīng)顯示位于核心蛋白的P1(MTSTNPKPQRKTKRNTN)以及NS3蛋白的P6(TGDFDSVID)這兩個B細(xì)胞表位與抗體反應(yīng)的滴度較高，提示二者在誘導(dǎo)HCV特異的體液免疫反應(yīng)中發(fā)揮主要作用。 PCX3蛋白可誘發(fā)較高水平的特異性CTL效應(yīng)，特異性殺傷率為39.2﹪。在多肽表位中，NS5B的T細(xì)胞表位(ELITSCSS)的溶解率最高，提示該表

6、位在誘發(fā)CTL殺傷效應(yīng)中具有重要的作用。流式細(xì)胞儀檢測外周血淋巴細(xì)胞表明，HCV多表位抗原PCX3免疫小鼠6周后，CD3+CD4+T細(xì)胞比例明顯升高，說明該蛋白可以有效刺激CD3+CD4+Th細(xì)胞增殖。針對免疫小鼠的安全性評價表明這一多表位抗原免疫是安全而有效的。 利用實(shí)時熒光定量PCR技術(shù)檢測PCX3抗血清體外與病毒粒子(genotype2a)的結(jié)合，實(shí)驗結(jié)果表明孵育過夜后，PCX3抗血清在體外能夠結(jié)合絕大部分的病毒粒子，初步

7、顯示PCX3抗血清具有抗病毒感染的可能，為進(jìn)一步抑制病毒感染的試驗提供基礎(chǔ)。 本實(shí)驗中用于檢驗體液免疫被動保護(hù)反應(yīng)的模型是SCID/Alb-uPA轉(zhuǎn)基因小鼠。這種SCID/Alb-uPA純合的小鼠體內(nèi)進(jìn)行人體肝細(xì)胞移植后，建立具有嵌合的人肝組織的轉(zhuǎn)基因小鼠。利用HCV陽性血清進(jìn)行腹膜內(nèi)注射感染，病毒不僅能夠復(fù)制，而且產(chǎn)生了具有感染性的顆粒，可以作為HCV感染的小鼠模型。利用該模型的研究表明HCV陽性血清(HCVgenotype1

8、a，3.0E+6IU/ml)與PCX3誘導(dǎo)的高滴度抗血清孵育過夜后進(jìn)行感染，兩周后檢測發(fā)現(xiàn)實(shí)驗組中有兩只小鼠血清中含有低于500U的RNA拷貝數(shù)，其它三只血清中的RNA則為陰性，而對照組的7只小鼠全部感染了HCV，血清中的RNA拷貝數(shù)為3.0E+03到3.5E+06IU/ml。這一結(jié)果表明PCX3誘導(dǎo)的抗血清能使2/5的小鼠病毒滴度顯著減少，并且保護(hù)3/5的小鼠避免HCV感染，在被動免疫保護(hù)反應(yīng)方面發(fā)揮重要的作用。 對PCX3抗

9、血清進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)它能與HCV的核心蛋白、NS3蛋白特異性結(jié)合，驗證了抗血清中含有抗核心蛋白與NS3蛋白的抗體。利用PCX3抗原制備的單克隆抗體中篩選到兩株分別與HCV核心蛋白以及NS3蛋白結(jié)合，一株與包膜蛋白E1的表位多肽P5(RMAWDMMMW)反應(yīng)的單抗。表明PCX3誘導(dǎo)的體液免疫反應(yīng)中包含這三個蛋白的B細(xì)胞表位(P1，P5和P6)所引起的免疫反應(yīng)，且這些單抗可用于進(jìn)一步研究抗體與病毒粒子的結(jié)合。在此基礎(chǔ)上，選取抗核心蛋白的雜交瘤