表達(dá)PEDV保護(hù)性抗原靶向融合肽乳酸桿菌活菌載體的構(gòu)建及其免疫原性分析.pdf

1、豬流行性腹瀉(PED)是由豬流行性腹瀉病毒(PEDV)引起的一種腸道傳染病，臨床特征為嚴(yán)重的腹瀉、嘔吐以及脫水。PED可發(fā)生于各年齡段豬只，但以仔豬最為易感，死亡率高達(dá)95％以上。PEDV感染具有明顯的腸嗜性，故通過(guò)黏膜免疫可有效預(yù)防本病的發(fā)生。
　　為實(shí)現(xiàn)良好的腸道黏膜免疫應(yīng)答，本實(shí)驗(yàn)以PEDV S蛋白中能夠誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生中和抗體的線性表位區(qū)ps420基因片段，定向插入乳酸菌質(zhì)粒表達(dá)載體，并電轉(zhuǎn)化乳酸桿菌，以此作為口服制劑探索腸道

2、黏膜對(duì)該病的特異性免疫效果。為提高抗原吸收和呈遞效率，在重組乳酸菌表達(dá)載體構(gòu)建中引入M細(xì)胞靶向肽基因序列co1和樹突狀細(xì)胞靶向肽基因序列DCpep，以增強(qiáng)機(jī)體的免疫應(yīng)答。
　　以臨床疑似PED腸道內(nèi)容物擴(kuò)增獲得PEDV S ps420基因片段，將其克隆到pET-32a，并轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)，獲得重組pET-32a-ps420/BL21。經(jīng)SDS-PAGE和Western blot檢測(cè)，確定目的蛋白ps420得到表達(dá)。純

3、化回收該蛋白，用于檢測(cè)脾淋巴細(xì)胞的增殖情況。
　　以融合PCR或SOE-PCR方法引入M細(xì)胞靶向肽co1編碼基因和樹突狀細(xì)胞靶向肽DCpep編碼基因，分別獲得融合基因ps420-co1、ps420-DCpep和ps420-co1-DCpep，將ps420、ps420-co1、ps420-DCpep和ps420-co1-DCpep插入乳酸桿菌組成型表面表達(dá)載體pPG-T7g10-PPT中，電轉(zhuǎn)化入干酪乳桿菌L.casei393中，得

4、到四株陽(yáng)性重組菌。重組菌分別命名為非靶向重組乳酸桿菌pPG-T7g10-PPT-ps420/L.casei393、單靶向M細(xì)胞重組乳酸桿菌pPG-T7g10-PPT-ps420-co1/L.casei393、單靶向樹突狀細(xì)胞重組乳酸桿菌pPG-T7g10-PPT-ps420-DCpep/L.casei393和雙靶向M細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞重組乳酸桿菌pPG-T7g10-PPT-ps420-co1-DCpep/L.casei393。
　　

5、將構(gòu)建的4株重組乳酸桿菌分別于37℃靜置培養(yǎng)約16h，經(jīng)Western blot檢測(cè)，重組菌均在預(yù)期位置表達(dá)了目的蛋白;激光共聚焦顯微鏡定位檢測(cè)結(jié)果顯示，表達(dá)ps420蛋白的4株重組菌菌體表面均可見(jiàn)黃綠色熒光，而未表達(dá)ps420蛋白的對(duì)照菌pPG-T7g10-PPT/L.casei393則未發(fā)現(xiàn)黃綠色熒光，表明重組干酪乳桿菌表達(dá)了目的蛋白并被展示于菌體表面。
　　為探討所構(gòu)建的表達(dá)PEDV S ps420蛋白的重組干酪乳桿菌對(duì)機(jī)體

6、免疫應(yīng)答水平的影響，本研究選用BALB/c小鼠為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，分組口服免疫不同靶向修飾的重組干酪乳桿菌，同時(shí)以口服PBS和空載體菌pPG-T7g10-PPT/L.casei393為對(duì)照。免疫分兩種程序進(jìn)行:一次免疫組和二次免疫組，接種劑量為100μL，含活菌數(shù)1×109 CFU。免疫后隔天收集小鼠新鮮糞便，每周采集小鼠血液、外生殖道黏液等樣品，并在末次免疫兩周后采集每組免疫鼠腸黏液。分別采用不同的方法檢測(cè)抗體及細(xì)胞因子水平:ELISA檢測(cè)黏

7、液和糞便樣品中特異性sIgA抗體水平和血清IgG抗體水平;MTT法檢測(cè)脾淋巴細(xì)胞增殖情況;試劑盒方法檢測(cè)IL-4、IFN-γ的水平。
　　ELISA檢測(cè)顯示，表達(dá)PEDV S ps420不同靶向修飾的重組乳酸桿菌免疫小鼠在一免后第7d即可檢測(cè)到較高的抗體水平，顯著于非靶向修飾重組菌pPG-T7g10-PPT-ps420/L.casei393免疫組，極顯著于對(duì)照組，且雙靶向修飾重組乳酸桿菌pPG-T7g10-PPT-ps420-co

8、1-DCpep/L.casei393的免疫效果優(yōu)于單靶向修飾重組乳酸桿菌pPG-T7g10-PPT-ps420-co1/L.casei393和pPG-T7g10-PPT-ps420-DCpep/L.casei393;經(jīng)二次免疫后，免疫組抗體水平上升明顯，極顯著于對(duì)照組。通過(guò)中和實(shí)驗(yàn)可知重組干酪乳桿菌誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生的血清抗體IgG具有病毒中和活性。此外，MTT以及IL-4、IFN-γ水平檢測(cè)結(jié)果顯示，重組干酪乳桿菌誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生的免疫應(yīng)答以T