25223.利用木聚糖產(chǎn)生乙醇的大腸桿菌基因工程菌的構(gòu)建

1、Fyj。’‘麓學位論文獨創(chuàng)性聲明本人鄭重聲明：1、堅持以搿求實、創(chuàng)新“的科學精神從事研究工作。2、本論文是我個人在導師指導下進行的研究工作和取得的研究成果。3、本論文中除引文外，所有實驗、數(shù)據(jù)和有關(guān)材料均是真實的。4、本論文中除引文和致謝的內(nèi)容外，不包含其他人或其它機構(gòu)已經(jīng)發(fā)表或撰寫過的研究成果。5、其他同志對本研究所做的貢獻均已在論文中作了聲明并表示了謝意。研究生簽名：邀盛日期：2壁乜ff：五學位論文使用授權(quán)聲明本人完全了解南京師范大

2、學有關(guān)保留、使用學位論文的規(guī)定，學校有權(quán)保留學位論文并向國家主管部門或其指定機構(gòu)送交論文的電子版和紙質(zhì)版；有權(quán)將學位論文用于非贏利目的的少量復制并允許論文進入學校圖書館被查閱；有權(quán)將學位論文的內(nèi)容編入有關(guān)數(shù)據(jù)庫進行檢索：有權(quán)將學位論文的標題和摘要匯編出版。保密的學位論文在解密后適用本規(guī)定。m研究生簽名：選盛日期：邊2幺叢：五產(chǎn)成本偏高，在一定程度上限制了燃料乙醇工業(yè)的發(fā)展。充分利用植物纖維素中的所有組分，是生產(chǎn)纖維素乙醇的一個關(guān)鍵因素。

3、常用的釀酒酵母和運動發(fā)酵單孢菌發(fā)酵只能利用葡萄糖，而不能利用植物纖維素類中的其它組分。到目前為止，自然界中尚未發(fā)現(xiàn)哪種微生物可以有效的利用植物纖維素代謝產(chǎn)生乙醇。本研究的主要目的就是構(gòu)建能夠利用木聚糖產(chǎn)乙醇的基因工程菌株，為半纖維素類生物質(zhì)的利用打下基礎(chǔ)。1Escherichiacoli作為模式微生物，發(fā)酵產(chǎn)乙醇途徑和分子基礎(chǔ)研究非常清楚。但是由于野生型的Ecoli缺少高活力的乙醇產(chǎn)生酶，厭氧發(fā)酵時的主要產(chǎn)物是各種有機酸，乙醇含量非常低

4、。為了提高Ecoli代謝產(chǎn)乙醇能力，將運動發(fā)酵單孢菌產(chǎn)乙醇代謝途徑中的關(guān)鍵酶基因丙酮酸脫羧酶基因(pdc)和乙醇脫氫酶基因(adhB)整合到Ecoli的染色體上。首先克隆運動發(fā)酵單孢菌來源的pdc和adhB基因，比較其自身啟動子和Ecoli來源的啟動子對pdc和adhB的表達效果。分別構(gòu)建pdc和adhB基因的整合載體，利用kRed同源重組技術(shù)將pdc和adhB依次整合到Ecoli染色體上的glmS基因位點處。試驗結(jié)果表明，在厭氧條件下

5、，該基因工程菌產(chǎn)乙醇能力有顯著提高，在LB培養(yǎng)基中發(fā)酵20h后，基因工程菌株可產(chǎn)乙醇05grL。為減少乙醇發(fā)酵中副產(chǎn)物乳酸的產(chǎn)生，通過對大腸桿菌的糖酵解以及碳代謝流向的分析，敲除大腸桿菌乳酸脫氫酶，以期減少有機酸的產(chǎn)生。試驗結(jié)果表明，在厭氧條件下，突變株生長情況明顯優(yōu)于出發(fā)菌株，并且在發(fā)酵產(chǎn)物中檢測不到乳酸的積累。2Ecoli不具備木聚糖降解酶，為構(gòu)建能夠利用木聚糖的基因工程菌，需引入木聚糖降解酶系中的關(guān)鍵酶一木聚糖酶。Bacillus