硒對(duì)氟致血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷的影響.pdf

1、目的： 研究不同濃度氟對(duì)體外培養(yǎng)人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞的損傷作用；不同濃度硒對(duì)體外培養(yǎng)人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)的影響；不同濃度的硒對(duì)不同濃度氟造成的血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷的拮抗作用。為硒拮抗氟致動(dòng)脈硬化的應(yīng)用提供理論依據(jù)。 方法： 人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞(Human umbilical vein endothelial cells，HUVEC)置于37℃，5％CO2，飽和濕度條件下培養(yǎng)。待細(xì)胞處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)

2、分組分為加氟組、加硒組、加氟加硒組。加氟組氟化鈉(NaF)濃度分別為0、100、400、700、1000、2000μmol/L。加硒組亞硒酸鈉(Na2SeO3)的濃度分別為0、50、100、500、1000、2000nmol/L。加硒加氟組氟化鈉(400、700、1000、2000μmol/L)+亞硒酸鈉(100 nmol/L)。連續(xù)培養(yǎng)48h后收集細(xì)胞培養(yǎng)液與細(xì)胞待用。瑞氏-吉姆薩染色(Wrigh-Giema staining)觀測(cè)細(xì)

3、胞形態(tài)，吖啶橙熒光染色(Acridine orang staining)測(cè)定細(xì)胞凋亡的情況。采用四唑鹽(Methyl thiazolyl tetrazolium，MTT)比色法測(cè)定細(xì)胞活性；檢測(cè)培養(yǎng)液中谷胱甘肽過氧化物酶(Glutathione Peroxidase，GSH-px)、超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase，SOD)、丙二醛(Malondialdehyde，MDA)的活性。檢測(cè)培養(yǎng)液中誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(

4、Inducible nitric oxide synthase，iNOS)、內(nèi)皮型一氧化氮合酶(Endothelial nitric oxide synthase，eNOS)的活性和濃度。采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)測(cè)定培養(yǎng)液中的細(xì)胞粘附因子(Intercellular cell adhesion molecule-1，ICAM-1)和血管粘附因子(Vasular

5、 cell adhesionmolecule-1，VCAM-1)的表達(dá)。采用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶連反應(yīng)(Reverse transcription polymersade chain reaction，RT-PCR)測(cè)定iNOS-mRNA、eNOS-mRNA的表達(dá)。結(jié)果采用多組間比較采用方差分析，兩兩比較采用q檢驗(yàn)。 結(jié)果： 1、氟對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷作用 1.1 細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察 瑞氏-吉姆薩染色發(fā)現(xiàn)加氟組細(xì)胞隨著

6、氟劑量增加數(shù)量開始減少，形態(tài)變化明顯；血管內(nèi)皮細(xì)胞的數(shù)量隨著濃度增大而減少，內(nèi)皮細(xì)胞中出現(xiàn)似成纖維細(xì)胞樣改變，細(xì)胞間隙增大。隨著NaF濃度增大，變形的細(xì)胞所占得比例越大。吖啶橙染色NaF濃度達(dá)到2000μmol/L時(shí)，細(xì)胞核有明顯變形，聚集在細(xì)胞邊緣，呈月牙形排列，并有少許熒光碎片。 1.2 氟化鈉對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的影響 HUVEC給予NaF處理后48h后，MTT法測(cè)定細(xì)胞增值，在低濃度NaF，對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)幾乎沒有作用(P>0

7、.05)，當(dāng)NaF濃度為700、1000μmol/L時(shí)，可以明顯抑制細(xì)胞得生長(zhǎng)(P<0.05)。當(dāng)濃度為2000μmol/L時(shí)抑制的作用更強(qiáng)。 1.3 氟對(duì)培養(yǎng)液中SOD、GSH-Px活性和MDA含量的影響 氟的劑量為100μmol/L時(shí)，SOD、GSH-px、MDA的活性或者是濃度都沒有顯著變化(P>0.05)。隨著NaF濃度增大，SOD、GSH-px的活性明顯的降低(P<0.05)，而MDA的濃度則明顯的升高(P<0

8、.05)。 1.4 氟對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞eNOS和iNOS表達(dá)的影響 低濃度氟對(duì)eNOS影響不大(p>0.05)，隨著氟濃度增大eNOS的活性逐漸減弱(p<0.01)。而iNOS的活性則隨著氟濃度的增高逐漸的增強(qiáng)(p<0.01)。RT-PCR檢測(cè)細(xì)胞eNOS mRNA和iNOS mRNA水平的變化，HUVEC與低濃度氟作用以后，其eNOS和的RT-PCRiNOS產(chǎn)物沒有明顯變化，但在氟濃度增大后具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

9、 1.5 檢測(cè)培養(yǎng)液中ICAM-1和VCAM-1濃度 當(dāng)NaF濃度時(shí)，培養(yǎng)液中的ICAM-1和VCAM-1的濃度并沒有顯著變化(P>0.05)。當(dāng)氟濃度增大，在400-2000μmol/L時(shí)，培養(yǎng)液中兩種粘附因子的濃度都明顯的增大，統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。 2、硒對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞的影響 通過研究硒對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞形態(tài)、細(xì)胞活性、培養(yǎng)液中SOD、GSH-px活性和MDA含量、內(nèi)皮細(xì)胞eNOS和i

10、NOS表達(dá)、內(nèi)皮細(xì)胞的ICAM-1和VCAM-1表達(dá)的影響，確定硒在濃度為100nmol/L時(shí)對(duì)細(xì)胞明顯有保護(hù)作用，從而確定硒的干預(yù)劑量為100nmol/L。 3、硒對(duì)氟造成血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷的干預(yù)作用 3.1 硒對(duì)氟造成細(xì)胞形態(tài)改變的影響 細(xì)胞在加硒加氟的培養(yǎng)液中培養(yǎng)48h后染色觀察，氟濃度100-700μmol/L細(xì)胞形態(tài)正常；當(dāng)加硒加氟組的氟濃度達(dá)到1000μmol/L時(shí)，出現(xiàn)零星成纖維樣細(xì)胞，當(dāng)加硒加氟組的

11、氟濃度達(dá)到2000μmol/L時(shí)，與加氟組沒有明顯的改變，細(xì)胞形態(tài)變化較大，細(xì)胞核可見濃染致密并可見熒光碎片。 3.2 硒對(duì)氟造成的細(xì)胞活性改變的影響 MTT測(cè)定細(xì)胞活性在不同組細(xì)胞中加入不同濃度的氟和硒共同培養(yǎng)48h后，MTT結(jié)果顯示，在氟(100-700μmol/L)+硒組時(shí)，細(xì)胞生長(zhǎng)并不受到抑制(P>0.05)。在氟(1000-2000μmol/L)+硒組時(shí)，細(xì)胞生長(zhǎng)明顯受到抑制(P<0.05)。但是與只加氟相比，

12、細(xì)胞增值都增高。 3.3 硒對(duì)氟造成內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)液中SOD、GSH-PX活性和MDA濃度改變的影響 與同劑量加氟組相比，在氟(400-1000μmol/L)+硒組SOD與GSH-Px在培養(yǎng)液中的活性明顯的增高(P<0.05)，而MDA濃度則明顯的降低(P<0.05)；氟(2000μmol/L)+硒組，SOD、GSH-Px活性和MDA濃度都沒有明顯的變化(P>0.05)。 3.4硒對(duì)氟造成內(nèi)皮細(xì)胞NOS的異常表達(dá)的

13、影響 與同劑量加氟組相比，氟(400，700μmol/L)+硒組培養(yǎng)液中iNOS的活性明顯的降低(P<0.05)，而eNOS的活性則明顯的增高(P<0.05)；氟(1000，2000μmol/L)+硒培養(yǎng)液中eNOS和iNOS活性沒有明顯的變化(P>0.05)。RT-PCR測(cè)定結(jié)果顯示，與同劑量加氟組比較，氟(400-1000μmol/L)+硒組iNOS mRNA表達(dá)明顯的降低(P<0.05)，而氟(2000μmol/L)+硒組

14、iNOS mRNA的表達(dá)沒有明顯的變化；氟(400，1000μmol/L)+硒組的eNOS mRNA表達(dá)明顯增高(P<0.05)，而氟(2000μmol/L)+硒組eNOS mRNA的表達(dá)沒有明顯變化。 3.5硒對(duì)氟造成內(nèi)皮細(xì)胞黏附因子異常表達(dá)的影響 與同劑量加氟組比較，氟(400-1000μmol/L)+硒組培養(yǎng)液中ICAM-1和VCAM-1的濃度明顯降低(P>0.05)，氟(2000μmol/L)+硒組培養(yǎng)液中ICA

15、M-1和VCAM-1的濃度則沒有明顯變化(P>0.05)。 結(jié)論： 1、高濃度氟可以使內(nèi)皮細(xì)胞的形態(tài)發(fā)生改變，并且可以導(dǎo)致細(xì)胞的調(diào)亡；適量劑量硒可以拮抗氟化鈉對(duì)細(xì)胞的損傷。 2、氟可以使培養(yǎng)液中的GSH-Px，SOD活性降低，使MDA的含量增高；適量濃度的硒可以改善這種現(xiàn)象，使SOD、GSH-Px活性明顯升高，MDA濃度下降。 3、氟可以抑制eNOS mRNA的表達(dá)，使培養(yǎng)液中的eNOS活性降低；可以刺激