創(chuàng)傷弧菌對血管內皮細胞損傷作用的初步研究.pdf

1、研究背景和目的：:
　　 創(chuàng)傷弧菌(Vibrio vulnificus,Vv)是弧菌屬第五群細菌,革蘭染色陰性,彎曲、桿狀、多形性、運動活潑、有莢膜的細菌,主要生長于海水中的魚類及貝母類等體內,為嗜鹽性海生弧菌?？煞譃?種生物型(Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型),其中Ⅰ型是導致人類創(chuàng)傷感染和原發(fā)性敗血癥的主要致病菌,一般通過外傷接觸含病菌的海水或生食海鮮兩種途徑感染。因此創(chuàng)傷弧菌感染是海上創(chuàng)傷醫(yī)學中的重要問題,也是海產品食品衛(wèi)生中的重要問題。其感

2、染后可引起人體嚴重感染、膿毒敗血癥,其引發(fā)的多器官功能障礙綜合癥是膿毒敗血癥患者死亡的主要因為,病死率高達50％以上。創(chuàng)傷弧菌膿毒敗血癥的形成主要是大量的創(chuàng)傷弧菌侵入到血液之中,而血管內皮細胞是阻擋創(chuàng)傷弧菌進入血管的重要屏障。因此,創(chuàng)傷弧菌對血管內皮細胞的損傷作用及機制是創(chuàng)傷弧菌敗血癥形成機制中的重要問題。
　　 為揭示創(chuàng)傷弧菌對血管內皮細胞的損傷作用,闡明創(chuàng)傷弧菌感染時對人血管內皮細胞結構的影響,我們進行了本項研究,為臨床創(chuàng)傷

3、弧菌感染的診治提供一定的理論依據。
　　 方法:
　　 1.創(chuàng)傷弧菌一般特性觀察和對血管內皮細胞的影響:
　　 1.1創(chuàng)傷弧菌標準株ATCC27562,購自中國科學院微生物研究所普通微生物保藏管理中心。復蘇培養(yǎng)后,行革蘭氏染色,光鏡觀察,劃線接種于硫代硫酸鹽-枸櫞酸鹽-膽鹽-蔗糖瓊脂(thiosulfate-cifrae-bile salt-sucrose,TCBS)平板及普通營養(yǎng)瓊脂平板觀察其菌落形態(tài),并接種于

4、弧菌屬生化鑒定管及生化條培養(yǎng)24h后,機讀細菌鑒定結果。
　　 1.2人臍靜脈血管內皮細胞(Human umbilical vein endothelial cell,HU),由廣州軍區(qū)廣州總醫(yī)院實驗科提供,對其進行Ⅷ因子免疫熒光鑒定。我們通過本課題組前期的實驗結果[6-7],對創(chuàng)傷弧菌對血管內皮細胞的攻擊濃度進行了界定,并通過96孔板培養(yǎng)實驗以及MTT法對不同濃度的創(chuàng)傷弧菌侵襲過的血管內皮細胞進行增殖抑制率的測定；細胞劃痕實驗

5、測量不同濃度的創(chuàng)傷弧菌對細胞遷移能力的影響；臺盼藍拒染法檢測細胞侵襲后即刻及24h細胞存活率；流式細胞儀測定不同濃度Vv對HU細胞凋亡的影響,選擇攻擊實驗Vv的最高的實驗終濃度103cfu/ml。通過Hoechest 33342熒光染色觀察HU細胞核的變化；平板克隆形成實驗檢測細胞集落形成能力的變化,以及50個高倍視野下正常細胞與侵襲后細胞核分裂數的變化,觀察極限殺傷濃度下細胞生物學行為的變化。對正常組和創(chuàng)傷弧菌攻擊組(104cfu/m

6、l)的細胞爬片進行細胞面積(Ac)和周長(Cc)、細胞核的面積(An)、胞漿面積(Acp)、核漿比(Rnp)以及細胞與核的長軸(dmaxc,dmaxn),細胞與核的短軸(dminc,dminn),軸比(Rac、Ran),細胞與核的形狀因子PE(PEc、PEn),細胞與核的形狀因子AR(ARc、ARn),細胞與核的規(guī)劃形狀因子RFF(RFFc、RFFn),形狀不規(guī)則指數FⅡ(FⅡc、FⅡn)等參數的體視學測量以檢驗人臍靜脈內皮細胞在創(chuàng)傷弧

7、菌攻擊下增殖能力和細胞形態(tài)的改變。
　　 2、創(chuàng)傷弧菌內毒素的提取、鑒定以及對血管內皮細胞的影響
　　 2.1取新鮮培養(yǎng)的創(chuàng)傷弧菌,利用酚水法提取細菌內毒素(LPS),并對LPS進行離心純化,以及根據2005版《中國藥典》規(guī)定用內毒素測定方法“鱟試劑”對其進行鑒定,并繪制濃度曲線,確定所提取的細菌LPS的濃度。
　　 2.2選擇創(chuàng)傷弧菌內毒素對細胞的半數致死濃度,選擇其上下濃度域共4個濃度對人臍靜脈內皮細胞進行M

8、TT,平板克隆,劃痕實驗測定細胞遷移能力的改變,以及流式細胞儀對細胞凋亡率的測定。對正常組和內毒素10000EU/ml攻擊組的細胞爬片進行細胞面積(Ac)和周長(Cc)、細胞核的面積(An)、周長(Cn)、細胞的體積(V),以及細胞的體積密度(Vv)、表面積密度(Sv)、數密度(Nv)等參數的體視學測量以檢驗人臍靜脈內皮細胞在創(chuàng)傷弧菌攻擊下增殖能力和細胞以及細胞核形態(tài)的改變,以判斷細菌內毒素對人臍靜脈內皮細胞損傷程度。
　　 3

9、、創(chuàng)傷弧菌溶細胞毒素的鑒定和濃度的測定,以及其對血管內皮細胞的影響
　　 3.1本課題組前期已重組大腸桿菌pET-32a-vvhA/E.coliBL21(DE3),行藍白斑篩選,挑選白色菌斑進行PCR擴增得到創(chuàng)傷弧菌溶細胞毒素(rVVC),對其進行SDS-PAGE電泳驗證,采用BCA(bicichoninicacid)法進行蛋白定量,繪制標準曲線,計算蛋白濃度。對SPF級BALB/c小鼠進行腹腔皮下多點注射,50mg/kg,小鼠

10、處死后對其立即解剖,取主要損傷臟器及組織固定、石蠟包埋后按常規(guī)方法制片、HE染色,光鏡下觀察病理變化。
　　 3.2選擇創(chuàng)傷弧菌溶細胞毒素對細胞的半數致死濃度,選擇其濃度域上下共4個濃度對人臍靜脈內皮細胞進行MTT,平板克隆,劃痕實驗測定細胞遷移能力,并用流式細胞儀對細胞凋亡率的測定。對正常組和溶細胞毒素3EU/ml攻擊組的細胞爬片進行細胞面積(Ac)和周長(Cc)、細胞核的面積(An)、周長(Cn)以及細胞的體積密度(Vv)、

11、表面積密度(Sv)、數密度(Nv)等參數的體視學測量以檢驗人臍靜脈內皮細胞在創(chuàng)傷弧菌溶細胞毒素(rVVC)攻擊下增殖能力和細胞形態(tài)的改變,以判斷細菌溶細胞毒素對人臍靜脈內皮細胞損傷程度。
　　 結論:
　　 創(chuàng)傷弧菌對體外培養(yǎng)的人臍靜脈內皮細胞具有明顯的殺傷作用,其殺傷濃度閾值為103cfu/ml。創(chuàng)傷弧菌、創(chuàng)傷弧菌內毒素(LPS)、創(chuàng)傷弧菌溶細胞毒素(VVC)對體外培養(yǎng)的人臍靜脈內皮細胞系(HU)的增殖有明顯的抑制作用