K-ras基因RNA干擾對胰腺癌細胞株增殖凋亡和信號通路的影響.pdf

1、背景：胰腺癌是目前已知惡性程度最高的腫瘤之一，它生長迅速，早期癥狀隱匿，發(fā)現(xiàn)時多已發(fā)生轉(zhuǎn)移，且對化療藥物敏感性不好，目前唯一證實有效的治療方法是手術(shù)切除。然而，由于發(fā)現(xiàn)多為晚期，只有少數(shù)病人有手術(shù)機會，且即使是術(shù)后5年生存率也在12％～20％之間。在西方國家，胰腺癌已列死亡率最高的惡性腫瘤第4位。
　　 胰腺癌的病因目前仍未研究清楚，多種環(huán)境因素和多個基因異常被認為在其發(fā)生過程中起作用。其中，癌基因的激活和抑癌基因的失活起到了重

2、要作用。K-ras基因是胰腺癌發(fā)生發(fā)展中最為重要的原癌基因。K-ras蛋白是小分子G蛋白，當它與GTP結(jié)合時為活性狀態(tài)，可進一步激活下游信號通路，調(diào)控細胞生長、增殖。正常情況下，Ras蛋白是一類在組織中廣泛存在的信號通路中心分子，具有重要生理功能。當Ras蛋白突變時，構(gòu)型改變，始終處于被激活的“鎖定”狀態(tài)，不需外界生長信號就可以持續(xù)激活下游信號分子，導致細胞無節(jié)制地異常增殖，最終發(fā)生腫瘤。本實驗室多年來研究一個與K-ras基因具有同源性

3、，而功能相反的抑癌基因ARHI，研究表明其作用可能通過抑制Ras經(jīng)典信號通路實現(xiàn)，甚至可以抑制Ras基因的表達。其與Ras相互作用的機制有待進一步研究。
　　 K-ras基因的突變類型多為點突變，尤以第一外顯子的第12位密碼子點突變最為多見。由于其為胰腺癌發(fā)生中的早期事件，又有突變頻率高，突變類型固定的特點，臨床上已將該位點作為胰腺癌早期診斷的新的分子標志物之一。此外，人們也希望將該位點作為胰腺癌早期治療的新的靶點。RNA干擾技

4、術(shù)的出現(xiàn)，給這種希望賦予了更大的可能。其高度特異性降解目標mRNA的特性，可特異性針對突變型的K-ras基因產(chǎn)生效應，而保留正常K-ras基因的功能。目前已有許多體外實驗和動物體內(nèi)實驗進行這方面的嘗試。
　　 目的：對K-ras突變型胰腺癌細胞系，特異性敲除K-ras基因，觀察對胰腺癌細胞的增殖、凋亡和細胞周期的影響，初步探討K-ras下游信號通路的改變情況，同時觀察ARHI表達的情況。
　　 方法：應用RNA干擾技術(shù)，

5、采用脂質(zhì)體介導的轉(zhuǎn)染小干擾RNA（siRNA）的方法，瞬時轉(zhuǎn)染PANC-1、MiaPaCa-2兩株細胞系，通過熒光顯微鏡和流式細胞儀測定轉(zhuǎn)染率。優(yōu)化條件后從RNA和蛋白水平驗證K-ras基因的轉(zhuǎn)錄和表達水平。繼而觀察K-ras干擾前后胰腺癌細胞增殖、凋亡和細胞周期的變化，以及K-ras相關(guān)的下游經(jīng)典信號通路Ras-Raf-ERK和Ras-PI-3K/AKT中的核心蛋白ERK和AKT的表達情況。以CCK-8細胞活力檢測試劑檢測細胞增殖；以

6、流式細胞儀PI染色法測定細胞凋亡和細胞周期；以凋亡小體染色和吖啶橙染色觀察干擾后細胞凋亡增多的形態(tài)學表現(xiàn)；以熒光實時定量PCR驗證K-ras表達下調(diào)情況下細胞周期相關(guān)因子Cyclin A和Cyclin E以及ARHI等的mRNA相對定量情況；以Western Blot檢測功能性ERK、功能性AKT和總AKT，以及與AKT調(diào)控有關(guān)的抑癌基因p53的蛋白水平和ARHI蛋白水平變化。結(jié)果：脂質(zhì)體介導的siRNA轉(zhuǎn)染效率在兩個細胞株均可達90％

7、以上。針對K-ras突變類型設(shè)計的siRNA可特異性敲除相應的K-ras基因，而不干擾其他突變類型。24h和48h提取的RNA均隨siRNA濃度升高產(chǎn)生明顯K-ras mRNA下調(diào)，siRNA終濃度達100nM時干擾效果最明顯。干擾：K-ras之后，MiaPaCa-2細胞增殖受到明顯抑制，重復測量方差分析p<0.05，PANC-1細胞差異未達顯著。兩株細胞系的凋亡率均增加，干擾組PANC-1、MiaPaCa-2凋亡細胞的百分率分別為22

8、.6％和32.1％，相對于對照組的9.7％和17.3％有顯著性差異（p<0.05）。凋亡形態(tài)學觀察可以得出相同的結(jié)論。細胞周期發(fā)生停滯，G1期增加，S期和G2期減少，PANC.1和MiaPaCa-2的G1期比例分別由50.4％、58.7％上升到65.1％和67.4％；S期由32.4％、26.5％下降至21.8％、21.7％；兩期的變化有明顯差異，p<0.05，而G2期差異不顯著；細胞周期相關(guān)因子Cyclin A和Cyclin E在mRN

9、A水平有下降趨勢，除MiaPaCa-2的cyclin A相對水平降至0.4.以外，其余下降幅度均未達50％。p-ERK、p-AKT蛋白表達明顯下調(diào)，而總AKT無明顯變化；p53表達明顯上調(diào)。蛋白水平變化于96h時更為明顯。ARHI蛋白在干擾后仍無表達，熒光實時定量PCR有差異，但因表達量太低，差異不明確。結(jié)論：對胰腺癌細胞株瞬時轉(zhuǎn)染特異性siRNA可特異性干擾K-rag突變序列，使MiaPaCa-2細胞增殖受到抑制，兩株細胞凋亡增加，細