關(guān)節(jié)液Marker對早期診斷骨關(guān)節(jié)炎的作用.pdf

1、隨著關(guān)節(jié)創(chuàng)傷的日漸增多，骨性關(guān)節(jié)炎(Osteoarthritis OA)已成為臨床多發(fā)病和常見病，嚴重影響著人類健康。由于本病發(fā)展緩慢，病程長，早期不引起癥狀或癥狀輕微，易被人忽視，而現(xiàn)有的診斷方法主要依靠病人的臨床癥狀和影像學表現(xiàn)，才能做出診斷。所以，在依靠放射學診斷前，我們不能早期作出診斷，進而阻斷OA的發(fā)展，這反映了我們?nèi)狈m當?shù)姆椒ūO(jiān)測關(guān)節(jié)軟骨的健康程度。而且現(xiàn)在的診斷方法和關(guān)節(jié)病分期只適合于術(shù)前計劃，并不適合于早期診斷和監(jiān)測疾

2、病發(fā)展。如何在創(chuàng)傷后早期診斷骨性關(guān)節(jié)炎，預測其發(fā)展趨勢，早期治療，從而延長關(guān)節(jié)使用壽命，減輕病人痛苦，是一個亟待解決的問題。
　　 毫無疑問，關(guān)節(jié)軟骨在病理狀態(tài)下，生化改變要早于形態(tài)學改變。尋求反映軟骨生化改變的生物標記物將對早期診斷有極大的幫助。關(guān)節(jié)液中的生物標記物(Biomarker)能夠直接反映患病關(guān)節(jié)的關(guān)節(jié)軟骨生化改變，且不受身體其它部位關(guān)節(jié)軟骨變化的影響，并且可以動態(tài)觀察。以往的研究中，結(jié)合關(guān)節(jié)鏡下軟骨損傷評分，我們分

3、析了多個關(guān)節(jié)液Marker，如:糖胺多糖、透明質(zhì)酸、金屬蛋白酶-3及其抑制劑-1、二型膠原羧基端肽、二型膠原螺旋肽等，雖然這些Marker被證明與軟骨損傷相關(guān)，特別是軟骨損傷早期，但是，由于個體差異較大，無法形成有效的標準應用于臨床。如何減少個體差異的影響，以及發(fā)現(xiàn)新的、特異性高的Marker成為關(guān)節(jié)液研究的方向。
　　 關(guān)節(jié)鏡下軟骨損傷評分是界定軟骨損傷的金標準，同時測定關(guān)節(jié)液中BM，能準確反映關(guān)節(jié)軟骨的代謝情況，我們設(shè)計了如

4、下研究內(nèi)容:
　　 Ⅱ型膠原是關(guān)節(jié)軟骨的特征性蛋白，圍繞Ⅱ型膠原的代謝，一方面測定了關(guān)節(jié)液中Ⅱ型膠原螺旋肽的含量，研究其與關(guān)節(jié)軟骨損傷程度間的關(guān)系;另一方面，同時測定關(guān)節(jié)液中其分解代謝產(chǎn)物Ⅱ型膠原羧基端端肽和合成代謝產(chǎn)物Ⅱ型前膠原羧基端前肽，通過觀察在關(guān)節(jié)軟骨損傷過程中二者之間的相互關(guān)系，研究Ⅱ型膠原代謝規(guī)律，早期診斷關(guān)節(jié)軟骨損傷;對于新發(fā)現(xiàn)的關(guān)節(jié)液Marker（印度刺猬蛋白）進行含量測定，結(jié)合軟骨損傷評分，研究其在早期診斷關(guān)節(jié)

5、軟骨損傷中的作用;通過表面增強激光解析電離飛行時間質(zhì)譜(SELDI-TOF-MS)技術(shù)結(jié)合弱陽離子芯片，研究不同損傷程度下關(guān)節(jié)液蛋白的差異位點，建立早期診斷關(guān)節(jié)軟骨損傷的差異位點模型，并為進一步蛋白組學研究提供方向;結(jié)合關(guān)節(jié)鏡下軟骨損傷評分和滑膜炎評分，分析滑膜炎和軟骨損傷之間的關(guān)系。
　　 本課題分為五部分:
　　 第一部分、關(guān)節(jié)液中Ⅱ型膠原螺旋肽(HELIX-Ⅱ)含量測定早期診斷關(guān)節(jié)軟骨損傷
　　 目的:研究

6、膝關(guān)節(jié)液中Ⅱ型膠原螺旋肽(HELIX-Ⅱ)的含量與關(guān)節(jié)鏡下膝關(guān)節(jié)軟骨損傷程度之間的關(guān)系，早期診斷關(guān)節(jié)軟骨損傷。
　　 方法:收集2008年3月至2008年10月在山西醫(yī)科大學第二醫(yī)院骨科行關(guān)節(jié)鏡診治和膝關(guān)節(jié)置換術(shù)的膝關(guān)節(jié)疾病患者關(guān)節(jié)液83例，采用ELISA法檢測其關(guān)節(jié)液HELIX-Ⅱ含量，依據(jù)Outerbridge軟骨損傷評分標準評價軟骨損傷程度，以損傷最重區(qū)域評分為最高評分，累加6個區(qū)域的評分即為該膝關(guān)節(jié)軟骨損傷累計評分。

7、r>　　 結(jié)果:膝關(guān)節(jié)液中HELIX-Ⅱ含量與Outerbridge軟骨損傷累計評分呈正相關(guān)(r=0.807，P＜0.05)，與Outerbridge軟骨損傷最高評分呈正相關(guān)(r=0.794，P＜0.05);軟骨損傷較重者（Outerbridge軟骨損傷最高評分為2分、3分和4分）HELIX-Ⅱ的含量明顯高于軟骨損傷較輕者（0分和1分組）(P＜0.05)，而損傷較重者之間無明顯差異。
　　 結(jié)論:膝關(guān)節(jié)液中HELIX-Ⅱ的含量

8、可作為生物標記物來早期判斷關(guān)節(jié)軟骨損傷，特別是可以反映軟骨是否有表面破裂這一病理變化，但不能用來監(jiān)測病情發(fā)展。
　　 第二部分、Ⅱ型膠原兩種不同代謝BM同時測定早期診斷關(guān)節(jié)軟骨損傷
　　 目的:通過同時測定不同程度關(guān)節(jié)軟骨損傷患者膝關(guān)節(jié)液中Ⅱ型膠原羧基端端肽(C-telopeptide of CⅡ，CTX-Ⅱ)與Ⅱ型前膠原羧基端前肽(ProcollagenⅡ C-propeptide，PⅡ CP)的含量，通過觀察二者之間

9、的相互關(guān)系，一方面描述關(guān)節(jié)軟骨損傷過程中的變化規(guī)律;另一方面研究二者在診斷關(guān)節(jié)軟骨損傷中的作用。
　　 方法:收集2009-2011年在我院行關(guān)節(jié)鏡診治或關(guān)節(jié)置換術(shù)，并且抽取關(guān)節(jié)液的患者47例共48膝，男25例(25膝)，女22例(23膝)，對納入病例行關(guān)節(jié)鏡手術(shù)或全膝關(guān)節(jié)表面置換術(shù)時，取髕下外側(cè)入路行膝關(guān)節(jié)腔穿刺抽取關(guān)節(jié)液，將關(guān)節(jié)液于取出后2小時內(nèi)，4500rpm，20分鐘條件下離心，留取上清液分裝于Eppendorf管中，快

10、速冷凍，在-80℃深低溫保存待測。根據(jù)膝關(guān)節(jié)鏡檢查或全膝關(guān)節(jié)表面置換術(shù)時所見，采用Outerbridge軟骨損傷評分法對髕骨面、股骨髕面、股骨內(nèi)側(cè)髁、股骨外側(cè)髁、脛骨內(nèi)側(cè)髁和脛骨外側(cè)髁共6個區(qū)域的關(guān)節(jié)軟骨損傷情況進行評分。按Outerbridge軟骨損傷評分最高評分將樣本分為0分、1分、2分、3分、4分5個組，按Outerbridge軟骨損傷累計評分將樣本分為＜10分組和≥10分組兩組，按性別將樣本分為男性和女性兩組。采用酶聯(lián)免疫吸附試

11、驗(ELISA法)對關(guān)節(jié)液CTX-Ⅱ(武漢中美科技，E90686Hu)與PⅡCP(武漢中美科技，E90964Hu)濃度進行測定。
　　 結(jié)果:關(guān)節(jié)液中CTX-Ⅱ和PⅡCP含量無論是作為單獨指標還是二者之間的比值，在不同關(guān)節(jié)軟骨損傷程度間的差異都不具有統(tǒng)計學意義(P＞0.05)，而且與軟骨損傷程度無相關(guān)性(P＞0.05);但是從數(shù)據(jù)分布來看，二者相對于軟骨損傷評分有明顯的下降趨勢。而且關(guān)節(jié)液中CTX-Ⅱ濃度和PⅡCP濃度具有正相關(guān)

12、(P＜0.05)。
　　 結(jié)論:關(guān)節(jié)液中CTX-Ⅱ和PⅡCP的濃度無論作為獨立指標，還是二者間比值，與軟骨損傷程度間無明顯相關(guān)關(guān)系;另外，總體上，CTX-Ⅱ和PⅡCP含量變化具有相關(guān)性，但每一個體，CTX-Ⅱ和PⅡCP含量變化并不一定同步?？傊?，CTX-Ⅱ和PⅡCP在描述骨關(guān)節(jié)炎病理生理過程具有一定的作用，但由于個體差異的影響，它們并不能作為標記軟骨損傷程度的Marker。
　　 第三部分、關(guān)節(jié)液Ihh含量變化與關(guān)節(jié)軟骨

13、損傷的關(guān)系
　　 目的:結(jié)合關(guān)節(jié)鏡下軟骨損傷評分，測定關(guān)節(jié)液中的印度刺猬蛋白(Ihh)含量，研究Ihh含量與軟骨損傷之間的關(guān)系，早期診斷關(guān)節(jié)軟骨損傷。
　　 方法:收集2010年67例在我院行關(guān)節(jié)鏡手術(shù)患者，其中男32例（32膝），女35例(35膝)。關(guān)節(jié)鏡手術(shù)時，行膝關(guān)節(jié)腔穿刺抽取關(guān)節(jié)液，將關(guān)節(jié)液于抽出后2小時內(nèi)，以4500rpm，20分鐘條件下離心，留取上清液分裝于Eppendorf管中，快速冷凍，在-80℃深低溫保

14、存待測。根據(jù)膝關(guān)節(jié)鏡檢查，采用Outerbridge軟骨損傷評分法對膝關(guān)節(jié)內(nèi)6個區(qū)域的關(guān)節(jié)軟骨損傷情況進行評分。按Outerbridge軟骨損傷評分最高評分將樣本分為0分、1分、2分、3分、4分5個組。采用酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA法）對關(guān)節(jié)液中ihh含量進行測定（武漢中美科技）。
　　 結(jié)果:在軟骨損傷最高評分2分以內(nèi)，Ihh含量成增高趨勢，2分以外呈下降趨勢;兩組間對比分析，0分與2分、0分與3分之間有顯著差異，p值分別是

15、1.237E-05和1.237E-05;1分與2分、2分與4分之間有顯著差異，p值分別是0.0250153和0.0017442。其它評分之間對比無顯著差異。
　　 結(jié)論:雖然Ihh含量在軟骨無損傷和軟骨極輕度損傷（Outerbridge評分=1）之間無明顯差異，但是Ihh含量在軟骨無損傷和軟骨輕度損傷（Outerbridge評分=2）之間有顯著差異。這樣對于臨床無癥狀或輕微，影像學檢查沒有表現(xiàn)的軟骨損傷較早期患者具有十分重要的意

16、義。Ihh含量升高提示關(guān)節(jié)軟骨損傷損傷。
　　 第四部分、 SELDI-TOF-MS技術(shù)在骨關(guān)節(jié)炎早期診斷中的應用
　　 目的:利用SELDI-TOF-MS技術(shù)尋找關(guān)節(jié)液中不同關(guān)節(jié)軟骨損傷條件下的差異位點，建立早期診斷關(guān)節(jié)軟骨損傷的診斷模型。
　　 方法:收集2009年在我院行關(guān)節(jié)鏡治療患者44例，其中男性24例，女性20例。關(guān)節(jié)鏡下評定軟骨損傷程度，應用表面增強激光解析電離飛行時間質(zhì)譜(SELDI-TOF-MS

17、)技術(shù)結(jié)合弱陽離子芯片，尋找關(guān)節(jié)液中不同軟骨損傷情況下的差異位點。
　　 結(jié)果:軟骨無損傷與軟骨輕度損傷差異位點10個;軟骨無損傷與軟骨中度損傷差異位點30個;軟骨輕度損傷與軟骨中度損傷差異位點17個。每個差異位點蛋白相對含量都以均數(shù)±標準差表示，所有的標準差相對均數(shù)均較大，未發(fā)現(xiàn)特異性高的蛋白或多肽。
　　 結(jié)論:運用SELDI-TOF-MS技術(shù)結(jié)合弱陽離子芯片研究關(guān)節(jié)液蛋白質(zhì)組學，是一種快捷有效的關(guān)節(jié)液差異蛋白篩選方

18、法，操作簡單，高通量，重現(xiàn)性好。本實驗未發(fā)現(xiàn)在軟骨損傷早、中期產(chǎn)生特異性高的蛋白質(zhì)或多肽;但是提示我們關(guān)節(jié)軟骨在損傷初期（Outerbridge評分＜4），關(guān)節(jié)軟骨代謝以合成代謝升高為主，而隨著軟骨損傷進一步發(fā)展，軟骨降解代謝迅速加強，這也許說明軟骨損傷可以在很早階段（Outerbridge評分＞6）發(fā)生不可逆改變。雖然發(fā)現(xiàn)了多個差異蛋白位點，但由于所有的差異點特異性都很不高，不能有效形成特異性節(jié)點，無法建立早期診斷模型。
　　

19、 第五部分、滑膜炎與關(guān)節(jié)軟骨損傷程度間的關(guān)系
　　 目的:研究不同關(guān)節(jié)軟骨損傷情況下關(guān)節(jié)滑膜的表現(xiàn)，并用其來分析二型膠原羧基端端肽（C-telopeptide of CollagenⅡ，CTX-Ⅱ）和二型前膠原羧基端前肽(ProeollagenⅡC-propeptide，PⅡCP)含量的數(shù)值分布情況，探討滑膜炎對測定結(jié)果的影響。
　　 方法:收集2001年至20008年關(guān)節(jié)鏡手術(shù)337例，共339膝，其中男性161例，女

20、性176例;年齡范圍11～82歲，平均42.9歲。采用Outerbridge評分標準分別對髕骨面、股骨髕面、股骨內(nèi)側(cè)髁、股骨外側(cè)髁、脛骨內(nèi)側(cè)髁、和脛骨外側(cè)髁共6個區(qū)域的關(guān)節(jié)軟骨損傷病理變化情況進行評分，并將評分累加。對滑膜采用Ayral評分法，對膝關(guān)節(jié)滑膜9個區(qū)域進行評分，按公式計算出滑膜炎評分。統(tǒng)計分析二者之間的關(guān)系。
　　 結(jié)果:軟骨損傷評分和滑膜炎評分做Spearman相關(guān)分析，結(jié)果表明軟骨損傷評分與滑膜炎評分呈正相關(guān)(r

21、=0.690，p＜0.001)。當軟骨損傷評分為零分時，將年齡和滑膜評分作Spearman相關(guān)分析，結(jié)果表明年齡與滑膜炎評分呈正相關(guān)(r=0.353，p＜0.001);性別．與滑膜炎兩者之間spearman相關(guān)系數(shù)為0.020，p值為0.827，提示兩者之間無相關(guān)性。
　　 結(jié)論:隨著軟骨損傷程度逐步加重，滑膜炎程度亦同時加重;然而，隨著滑膜炎程度逐步加重，軟骨損傷程度并不一定加重（出現(xiàn)最嚴重滑膜炎時，軟骨也不一定有損傷）;并且