抗人DR5單鏈抗體特性鑒定及體內(nèi)外功能分析.pdf

1、目的
　　 肺癌是目前世界上最常見(jiàn)的惡性腫瘤，從大體上可分為小細(xì)胞肺癌(SCLC)和非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)。其中大部分為非小細(xì)胞肺癌，約占80％，小細(xì)胞肺癌約占20%。約65%～70%的非小細(xì)胞肺癌在就診時(shí)就已處于晚期。早期小細(xì)胞肺癌可以取得較好的治療效果。但晚期的非小細(xì)胞肺癌無(wú)論手術(shù)或者放射治療均不能取得滿意的治療效果。單克隆抗體作為一種新的治療方法，雖然在臨床上還不夠成熟，但是它是一種具有很大潛力的免疫學(xué)治療方法。

2、>　　 目前現(xiàn)有的研究證實(shí)，抗DR5單克隆抗體(aDR5mAb)可通過(guò)與DR5的特異性結(jié)合，誘導(dǎo)表達(dá)DR5的腫瘤細(xì)胞凋亡，但同時(shí)也有報(bào)道證明抗DR5單克隆抗體亦存在肝毒性。目前制備的抗DR5單克隆抗體多數(shù)屬于鼠源性，直接作用人體會(huì)產(chǎn)生機(jī)體排斥反應(yīng)，降低治療效果。故為了降低人體對(duì)單克隆抗體的排斥反應(yīng)，對(duì)單克隆抗體進(jìn)行改造，成為了新的方向。本實(shí)驗(yàn)室已制備出抗人DR5單克隆抗體，并證實(shí)其能明顯的誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡且無(wú)明顯肝毒性，本實(shí)驗(yàn)室釣出了

3、該單克隆抗體的輕重鏈基因，構(gòu)建并表達(dá)了抗DR5單鏈抗體。為了進(jìn)一步研究單鏈抗體的功能，我們擬探討其特性，體內(nèi)抑瘤效果及與放療聯(lián)合的作用體外抑瘤效果。
　　 方法:
　　 本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建了抗DR5單鏈抗體(aDR5scFv)，通過(guò)ELISA方法對(duì)單鏈抗體進(jìn)行了特異性分析。通過(guò)MTT法檢測(cè)aDR5scFv對(duì)肺腺癌細(xì)胞973的細(xì)胞毒效應(yīng)；流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)aDR5scFv誘導(dǎo)973的凋亡率；Western blot檢測(cè)Bax，cas

4、pase-3，細(xì)胞色素c的蛋白表達(dá)；為了研究體內(nèi)aDR5scFv對(duì)肺腺癌的作用，我們應(yīng)用973細(xì)胞建立了裸鼠肺腺癌模型，腹腔注射給藥，并聯(lián)合放射治療，觀察aDR5scFv的體內(nèi)抑瘤效果，通過(guò)HE染色和TUNEL分析其可能機(jī)制。
　　 結(jié)果:
　　 結(jié)果發(fā)現(xiàn)aDR5scFv能夠與eDR5特異結(jié)合，MTT結(jié)果顯示aDR5scFv抑制973細(xì)胞生長(zhǎng)呈劑量依賴性，aDR5scFv終濃度分別為0.225，0.45，0.9，1.2m

5、g/mL應(yīng)用200μL時(shí)，對(duì)973細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制率分別為28.8%，52.3%，65.3%，89.8%；與流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果相符。Western blot檢測(cè)到aDR5scFv作用細(xì)胞4h后Bax，caspase-3，細(xì)胞色素c蛋白表達(dá)上調(diào)。
　　 體內(nèi)實(shí)驗(yàn)觀察到aDR5scFv實(shí)驗(yàn)組與空白組相比，腫瘤體積明顯減小，并觀察到aDR5scFv與放療聯(lián)合應(yīng)用時(shí)，腫瘤體積明顯小于單獨(dú)應(yīng)用組。TuneL及HE染色發(fā)現(xiàn)aDR5scFv與放