抗人DR5單抗誘導(dǎo)Jurkat和U937細(xì)胞凋亡機(jī)制研究.pdf

1、背景:腫瘤壞死因子相關(guān)的凋亡誘導(dǎo)配體(tumor necrosis factor-relatedapoptosis-inducing ligand，TRAIL)發(fā)現(xiàn)于1995年，是腫瘤壞死因子超家族的一員，它因能夠特異性地誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡而對(duì)大多數(shù)正常細(xì)胞沒(méi)有毒性而備受人們的關(guān)注。TRAIL的生物學(xué)效應(yīng)是通過(guò)與細(xì)胞膜上的相應(yīng)受體結(jié)合啟動(dòng)內(nèi)源和外源性信號(hào)傳導(dǎo)途徑而產(chǎn)生的。DR4(TRAIL-R1)和DR5(TRAIL-R2)是TRAIL的

2、死亡受體，其與TRAIL結(jié)合能夠傳導(dǎo)凋亡信號(hào)，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。雖然TRAIL有良好的抗腫瘤作用，但研究發(fā)現(xiàn)某些版本的rTRAIL對(duì)正常肝細(xì)胞有毒性作用，使人們對(duì)其生物安全性產(chǎn)生了懷疑。研究發(fā)現(xiàn)一些抗DR4和DR5的單克隆抗體(mAb)能夠模擬TRAIL誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的作用且無(wú)肝細(xì)胞毒性，因此研制抗人DR4和DR5的功能性單克隆抗體(mAb)成為TRAIL腫瘤生物治療的有效替代品，此類的單抗已初步顯示出了在癌癥治療方面的潛力。我們?cè)趯?shí)

3、驗(yàn)中篩選出了一個(gè)新的小鼠抗人DR5單抗mDRA-6，該抗體在體外無(wú)交聯(lián)劑的條件下能夠誘導(dǎo)多種腫瘤細(xì)胞凋亡，而且表現(xiàn)出很好的體內(nèi)腫瘤殺傷活性。 目的:探討抗人DR5單抗mDRA-6誘導(dǎo)Jurkat和U937細(xì)胞凋亡機(jī)制。 方法:瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)Jurkat和U937細(xì)胞DNA的片段化降解；MTT法檢測(cè)mDRA-6對(duì)Jurkat和U937細(xì)胞生長(zhǎng)抑制作用；Annexin V-FITC/PI雙染流式細(xì)胞儀定量分析技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞

4、凋亡；免疫印跡技術(shù)(Western blotting)檢測(cè)細(xì)胞相關(guān)凋亡蛋白的激活情況；免疫沉淀法和銀染法檢測(cè)細(xì)胞DISC復(fù)合物：RT-PCR法檢測(cè)Jurkat和U937細(xì)胞DR5、Caspase-8和Caspase-10 mRNA的表達(dá)情況。 結(jié)果:1.10μg/ml的mDRA-6作用Jurkat和U937細(xì)胞6h后，瓊脂糖凝膠電泳顯示DNA片段化降解，表現(xiàn)為梯形DNA電泳條帶，預(yù)先用Caspase抑制劑干預(yù)后mDRA-6作用J

5、urkat和U937細(xì)胞，無(wú)明顯DNA梯形電泳條帶顯示。 2.MTT結(jié)果表明，10μg/ml的mDRA-6作用Jurkat和U937細(xì)胞2h后凋亡率分別為59.97％和42.38％；應(yīng)用Caspase-8和Caspase-10抑制劑干預(yù)后，mDRA-6致Jurkat細(xì)胞死亡率分別降低45.32％(P<0.05)和4.52％(P>0.05)；mDRA-6致U937細(xì)胞死亡率分別降低4.33％(P>0.05)和30.36％(P<0.

6、05)。 3.Annexin V- FITC/PI雙染流式細(xì)胞儀檢測(cè)10μg/ml的mDRA-6作用Jurkat和U937細(xì)胞2h，細(xì)胞凋亡率分別為62.62％和35.65％；預(yù)先用廣譜Caspase-8抑制劑、Caspase-10抑制劑、Caspase-9抑制劑和Caspase抑制劑Z-VAD-FMK干預(yù)，mDRA-6致Jurkat細(xì)胞凋亡率分別減少45.87％、4.33％、46.44％和42.75％，mDRA-6致U937細(xì)

7、胞凋亡率分別減少0.89％、11.67％、2.33％和1.57％。預(yù)先用JNK抑制劑和NF-кB抑制劑干預(yù)，mDRA-6致Jurkat細(xì)胞凋亡率分別增加10.63％和5.14％，mDRA-6致U937細(xì)胞凋亡率分別增加26.67％和21.1％。 4.免疫印跡技術(shù)檢測(cè)顯示，mDRA-6作用Jurkat和U937細(xì)胞不同時(shí)間后提蛋白，Jurkat和U937細(xì)胞Caspase-3、-9、PARP、P-38、Bax、Bcl-2、Bcl-

8、xL均有激活表現(xiàn)：而Caspase-8僅在Jurkat細(xì)胞有激活顯示，Caspase-10僅在U937細(xì)胞有激活顯示；Caspase全抑制劑干預(yù)后，Jurkat和U937細(xì)胞Caspase-3、-9及PARP的激活片段被抑制；此外Jurkat和U937細(xì)胞子mDRA-6作用5min后JNK呈現(xiàn)活性片段表達(dá)，并隨mDRA-6作用時(shí)間的延長(zhǎng)其活性增強(qiáng)；Caspase全抑制劑干預(yù)后，mDRA-6作用5min、15minJNK磷酸化增強(qiáng)，但隨m

9、DRA-6作用時(shí)間的延長(zhǎng)，JNK磷酸化逐漸減弱。 5.免疫沉淀法結(jié)果顯示，與裸細(xì)胞組相比較，mDRA-6作用U937細(xì)胞后有Caspase-10的特異條帶出現(xiàn)，而mDRA-6作用Jurkat細(xì)胞后沒(méi)有Caspase-10的特異條帶出現(xiàn)。 6.RT-PCR法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，U937細(xì)胞Caspase-10 mRNA表達(dá)高于Jurkat細(xì)胞，而Jurkat和U937細(xì)胞DR5和Caspase-8 mRNA表達(dá)無(wú)明顯差異。

10、結(jié)論:1.mDRA-6能夠誘導(dǎo)人白血病Jurkat和U937細(xì)胞凋亡，其機(jī)制是主要激活死亡受體信號(hào)傳導(dǎo)途徑；Jurkat激活起始Caspase-8誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，U937細(xì)胞激活起始Caspase-10誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。Jurkat和U937細(xì)胞通過(guò)不同的起始Caspase誘導(dǎo)凋亡，可能與U937細(xì)胞Caspase-10 mRNA表達(dá)明顯高于Jurkat細(xì)胞有關(guān)。 2.mDRA-6誘導(dǎo)白血病細(xì)胞凋亡過(guò)程中有JNK和NF-кB的激活并且