人源性抗巨噬細(xì)胞移動抑制因子單鏈抗體的篩選及初步鑒定.pdf

1、人巨噬細(xì)胞移動抑制因子(Human macrophage migration inhibitory factor,hMIF)是一種重要的免疫調(diào)控細(xì)胞因子,組成性表達(dá)于全身多種組織,垂體前葉細(xì)胞、活化的T淋巴細(xì)胞、單核巨噬細(xì)胞等是其主要來源。hMIF基因編碼區(qū)為348bp,編碼由115個氨基酸組成分子量約為12.5KD的非糖基化蛋白。hMIF除細(xì)胞因子的基本功能外,還具有類似激素、生長因子、應(yīng)激反應(yīng)蛋白及糖基化抑制因子(GIF)等的多重作

2、用,并可調(diào)節(jié)機(jī)體的免疫應(yīng)答。已有的研究表明,MIF異常高表達(dá)是引起膿毒癥、糖皮質(zhì)激素拮抗、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、某些腫瘤的重要原因之一。以具有中和作用的MIF單克隆抗體治療膿毒癥小鼠,發(fā)現(xiàn)可顯著提高其存活率,提示阻斷MIF的作用可抑制MIF高表達(dá)所引起的相關(guān)病理過程。研究還揭示MIF在人鼠之間高度保守,其抗體制備困難;且抗體進(jìn)入臨床應(yīng)用,人源化問題也是一大障礙。隨著抗體庫技術(shù)的出現(xiàn),為人源抗體的制備提供了新的有效途徑。本研究擬先制備具有生物學(xué)

3、活性的重組hMIF再從大容量的全合成的人源性單鏈抗體庫中篩選抗hMIF的單鏈抗體,并進(jìn)行初步鑒定;為進(jìn)一步獲得一種具有潛在臨床治療前景的MIF特異性抗體抑制劑奠定基礎(chǔ)。
　　 主要研究內(nèi)容和結(jié)果
　　 1.功能性hMIF的制備與鑒定
　　 1)構(gòu)建了PET11b-hMIF,PET32a-Trx-MIF重組質(zhì)粒,酶切測序正確后,轉(zhuǎn)化BL21,IPTG誘導(dǎo)表達(dá)后,與預(yù)期的結(jié)果一致,SDS-PAGE顯示PET11b-h

4、MIF在12.5KD,而PET32a-Trx-MIF在30KD處出現(xiàn)了一條表達(dá)條帶,兩者的表達(dá)量約占菌體總蛋白30％,且為可溶性表達(dá)。
　　 2)應(yīng)用SP Sepharose FF陽離子交換層析和Hitrap26/60 sephacryl S-300分子篩純化誘導(dǎo)表達(dá)的hMIF;應(yīng)用His親和層析柱純化誘導(dǎo)表達(dá)的Trx-MIF。SDS-PAGE灰度掃描顯示hMIF純度為95％,Trx-MIF純度為85％。Western Blot

5、鑒定證明hMIF和Trx-MIF均能與特異性的MIF抗體結(jié)合。
　　 3)用L-3,4-二羥基苯丙氨酸甲酯作為底物對hMIF,Trx-MIF互變異構(gòu)酶的活性進(jìn)行檢測。hMIF具有明顯的互變異構(gòu)酶的活性(0.49±0.01),Trx-MIF(0.01±0.01)與無關(guān)陰性對照PreS1(0.02±0.02)無互變異構(gòu)酶的活性,結(jié)果具有顯著性差異(P＜0.01)。
　　 4)通過hMIF,Trx-MIF刺激RAW264.7細(xì)

6、胞釋放NO,TNF-α,IL-6檢測其細(xì)胞因子活性。結(jié)果顯示hMIF在體外能劑量依賴性地刺激RAW264.7細(xì)胞釋放NO和TNF-α,IL-6,而Trx-MIF不能刺激這些炎性細(xì)胞因子的釋放。
　　 5)盲腸結(jié)扎穿孔術(shù)(CLP)小鼠在術(shù)后12小時,分別腹腔注射5mg/kg重組hMIF和Trx-MIF,對比觀察對生存率的影響。MIF組較CLP對照組生存率明顯降低(p＜0.05),Trx-MIF組生存率與CLP對照組相比無明顯變化。

7、
　　 2.人源性MIF單鏈抗體的篩選及初步鑒定
　　 1)用純化的有生物學(xué)活性的hMIF作為抗原對全合成人源性單鏈抗體庫(庫容為1.35×1010)進(jìn)行了3輪篩選,3輪抗原包被的濃度依次為10μg/ml,5μg/ml,2.5μg/ml。
　　 2)從第3輪篩選后的平板上,隨機(jī)挑取共24個單菌落制備噬菌體抗體,經(jīng)Phage-ELISA檢測有9株與hMIF結(jié)合呈陽性,取其中4株強(qiáng)陽性的克隆(OD值＞2.0),通過噬

8、菌體展示與hMIF,Trx-MIF,B型腦鈉肽(Trx-BNP),降鈣素基因相關(guān)肽(CGRP)進(jìn)行結(jié)合特異性的檢測。結(jié)果顯示這4株均能與hMIF,TrxMIF特異性結(jié)合,而與無關(guān)Trx-BNP,CGRP無反應(yīng)。
　　 3)將這4株陽性克隆的單克隆細(xì)菌提取質(zhì)粒,經(jīng)SfiⅠ和NotⅠ雙酶切,結(jié)果經(jīng)1％凝膠電泳可見酶切產(chǎn)物大小約為750bp,與單鏈抗體的大小一致。用Vector NTI軟件,以及NCBI的Igblast數(shù)據(jù)庫,比對發(fā)現(xiàn)

9、A2-1與B2-3共用一套框架系統(tǒng),基因?qū)儆讦?H3家族;C14與M2H7共用一套框架系統(tǒng),基因?qū)儆讦?H3家族。同時發(fā)現(xiàn)B2-1,C1-4,M2H7輕鏈CDR3區(qū)中出現(xiàn)了TAG琥珀終止密碼子,由于我們的噬菌體展示載體上它能夠20％通讀為Q(CAG),若要進(jìn)行其他系統(tǒng)表達(dá),TAG琥珀終止子就要進(jìn)行突變改造。利用重疊延伸PCR對B2-3,C1-4,M2H7三株scFv基因中的TAG終止子進(jìn)行了突變,并把其基因克隆進(jìn)原核表達(dá)載體PTIG-r

10、rx,測序結(jié)果顯示三株的TAG都成功突變?yōu)镃AG。
　　 4)選取序列中無終止子的A2-1噬粒,經(jīng)SfiⅠ和NotⅠ雙酶切,克隆進(jìn)原核表達(dá)載體PTIG-Trx,選取陽性克隆轉(zhuǎn)化BL21(DE3),用0.1mmol/L的IPTG進(jìn)行37℃誘導(dǎo)表達(dá)6h,SDS-PAGE顯示為包涵體表達(dá),表達(dá)量約占細(xì)菌總蛋白的40％。
　　 5)應(yīng)用鼠抗His單抗,進(jìn)一步進(jìn)行Western blot檢測,發(fā)現(xiàn)經(jīng)IPTG誘導(dǎo)的PTIG-Trx-

11、A2-1scFv在30kDa處顯示出一條特異性條帶。與預(yù)期的MIF scFv的分子量相符,空質(zhì)粒載體PTIG-Trx的誘導(dǎo)全菌為陰性。表明感染菌經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后正確表達(dá)了MIF scFv。
　　 6)應(yīng)用His親和純化MIF(A2-1)scFv,收集5％,10％,100％洗脫液。分別進(jìn)行SDS-PAGE電泳。10％沈脫液中含有較純的MIF scFv,純度可達(dá)95％左右。用ELISA分析純化后的MIF(A2-1)的特異性,1∶10

12、00稀釋MIF(A2-1)scFv,hMIF吸光度值為(2.4±0.1),Trx-MIF吸光度值為(0.89±0.2)與無關(guān)蛋白組BNP吸光度值為(0.389±0.08),CGRP吸光度值為(0.272±0.05),具有顯著性差異(P＜0.01)。
　　 綜上所述,本研究首先通過構(gòu)建PET11b-MIF、PET32a-MIF表達(dá)載體,建立重組MIF純化方案,通過體內(nèi)、體外實驗對不同表達(dá)方式的重組hMIF的互變異構(gòu)酶活性、促進(jìn)炎癥