葉酸與DNKMT1對FHIT基因在宮頸癌細(xì)胞中表達(dá)的影響.pdf

1、目的:
　　 宮頸癌是常見的女性惡性腫瘤，流行病學(xué)和實驗研究均表明，高危型人乳頭瘤病毒(HR-HPV)的持續(xù)感染是導(dǎo)致宮頸癌發(fā)生的原因之一，但不是唯一因素。葉酸參與DNA的合成和DNA甲基化，其在宮頸癌中的作用日益受到關(guān)注。DNA甲基化是目前研究最為廣泛的表觀遺傳學(xué)事件，而DNMT1作為這一過程中的關(guān)鍵酶，已被證實與多種腫瘤的發(fā)生有關(guān)。脆性組氨酸三聯(lián)基因(FragileHistidine Triad gene，F(xiàn)HIT)是目前宮

2、頸癌研究中報道最多的抑癌基因之一。其5'端CpG島的超甲基化可能是其失活的主要機(jī)制。已有研究報道，葉酸可影響DNMT1的活性;且補(bǔ)充葉酸可使FHIT蛋白表達(dá)升高，但葉酸是否通過DNA甲基化過程而影響宮頸癌細(xì)胞中FHIT基因的表達(dá)，目前未見相關(guān)報道。本次實驗將采用體外研究方法對其加以探討。
　　 方法:
　　 運用瞬時轉(zhuǎn)染技術(shù)將重組質(zhì)粒和空質(zhì)粒導(dǎo)入宮頸癌C33A和Caski細(xì)胞中，設(shè)立未轉(zhuǎn)染組作為對照，分別向未轉(zhuǎn)染組、空質(zhì)

3、粒組和重組組中添加不同濃度葉酸，采用細(xì)胞計數(shù)檢測宮頸癌細(xì)胞的生長情況，流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞的增殖及凋亡情況，Real-time PCR檢測DNMT1、FHIT及HPV16癌基因E6、E7 mRNA的表達(dá)情況，Western-blot法檢測DNMT1和FHIT蛋白表達(dá)情況。
　　 結(jié)果:
　　 1.葉酸對宮頸癌細(xì)胞生長及DNMT1、FHIT基因表達(dá)的影響:(1)隨著葉酸濃度的增加抑制率呈上升趨勢(C33A: r=0.976，

4、P＜0.001;Caski:r=0.952，P＜0.001)，除10μ g/ml濃度組外，實驗組與對照組相比均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。(2)施加不同濃度葉酸后，細(xì)胞周期增殖指數(shù)降低（C33A:r=-0.736，P=0.001;Caski: r=-0.864，P＜0.001）;凋亡率逐漸增加(C33A: r=0.776,P＜0.001;Caski: r=0.679，P=0.002)。(3)兩種細(xì)胞在高濃度葉酸500μ g/ml和10

5、00μ g/ml組中DNMT1mRNA和蛋白的相對表達(dá)量與1μ g/ml組相比有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。(4)施加葉酸干預(yù)后，C33A細(xì)胞中，1μ g/ml組FHIT基因甲基化陽性，500和1000μ g/ml組FHIT基因甲基化陰性，其余濃度組部分甲基化;Caski細(xì)胞中，500μ g/ml和1000μ g/ml組FHIT基因甲基化陰性，250μ g/ml組FHIT基因部分甲基化，其余濃度組FHIT甲基化陽性。(5)隨著葉酸濃度的

6、增加宮頸癌細(xì)胞FHITmRNA(C33A:r=0.853，P＜0.001，Caski: r=0.919，P＜0.001)與蛋白(C33A: r=0.721，P=0.001，Caski: r=0.801，P＜0.001)相對表達(dá)量呈升高趨勢，在500.0、1000.0μ g/ml組與對照組(1μ g/ml)相比有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。(6)葉酸對Caski細(xì)胞HPVE6癌基因mRNA相對表達(dá)量無影響;HPVE7癌基因mRNA表達(dá)量降

7、低（r=-0.728，P=0.001），1000μ g/ml與對照組相比有意義。
　　 2.DNMT1對宮頸癌細(xì)胞生長及FHIT基因表達(dá)的影響:(1)重組質(zhì)粒與空質(zhì)粒經(jīng)酶切鑒定，分別在291bp和290bp處獲得兩條重組片段。重組質(zhì)粒和空質(zhì)粒成功轉(zhuǎn)染宮頸癌細(xì)胞C33A和Caski，轉(zhuǎn)染率為65％和63％，DNMT1基因抑制率為53％和52％。(2)重組組中宮頸癌C33A和Caski細(xì)胞活細(xì)胞數(shù)減少，與未轉(zhuǎn)染組相比有統(tǒng)計學(xué)意義(P

8、＜0.05);細(xì)胞增殖指數(shù)降低，凋亡率升高，與未轉(zhuǎn)染組和空質(zhì)粒組相比有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。(3) DNMT1干擾后，未轉(zhuǎn)染組與空質(zhì)粒組，F(xiàn)HIT甲基化呈陽性，而非甲基化陰性。重組組中，出現(xiàn)了非甲基化條帶，未見甲基化。(4)轉(zhuǎn)染后，重組組與未轉(zhuǎn)染組相比，F(xiàn)HITmRNA與蛋白相對表達(dá)量增加，且差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05);空質(zhì)粒組與未轉(zhuǎn)染組細(xì)胞相比表達(dá)量無明顯差別。(5)DNMT1干擾對Caski細(xì)胞HPV16E6癌基因的表達(dá)

9、量無明顯影響;重組組E7癌基因相對表達(dá)量降低，與對照組相比有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。
　　 3.葉酸、DNMT1對宮頸癌細(xì)胞生長及FHIT基因表達(dá)的影響:(1)宮頸癌C33A和Caski細(xì)胞中，三組細(xì)胞均隨著葉酸濃度的增加活細(xì)胞數(shù)逐漸減少，未轉(zhuǎn)染組與重組組除10μ g/ml組外，與對照組(1μ g/ml)相比均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)?？召|(zhì)粒組中各實驗組與對照組(1μ g/ml)相比有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。相同葉酸

10、濃度下，重組組與空質(zhì)粒組，重組組與未轉(zhuǎn)染組相比活細(xì)胞數(shù)減少，且差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。(2)細(xì)胞增殖，C33A細(xì)胞重組組中，隨著葉酸濃度的增加周期增殖指數(shù)逐漸降低，500μ g/ml和1000μ g/ml組與1μ g/ml組相比有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。Caski細(xì)胞，空質(zhì)粒組與重組組細(xì)胞均隨著葉酸濃度的增加，細(xì)胞周期增殖指數(shù)逐漸降低，且500μ g/m1和1000μ g/ml組與對照組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)

11、。相同葉酸濃度下，重組組與未轉(zhuǎn)染組和空質(zhì)粒組相比，細(xì)胞周期增殖指數(shù)降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。隨著葉酸濃度的增加，重組組與空質(zhì)粒組C33A和Caski細(xì)胞的凋亡率逐漸升高，除10μ g/ml組外，其它各實驗組與1μ g/m1組相比有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。相同葉酸濃度下，重組組中兩種細(xì)胞的凋亡率均較未轉(zhuǎn)染組和空質(zhì)粒組的高，且差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。(3) FHIT基因甲基化，C33A細(xì)胞，空質(zhì)粒組中1000μ

12、g/ml組FHIT甲基化陰性，500μ g/ml組FHIT基因部分甲基化，其余濃度組中FHIT甲基化陽性;重組組中各葉酸濃度組FHIT基因甲基化陰性。Caski細(xì)胞，空質(zhì)粒組中250μ g/ml、500μ g/ml和1000μ g/ml組FHIT基因非甲基化陽性，其余濃度組FHIT甲基化陽性;重組組FHIT甲基化陰性。(4) FHIT蛋白表達(dá)，未轉(zhuǎn)染組和空質(zhì)粒組細(xì)胞FHITmRNA相對表達(dá)量逐漸升高，500μ g/ml和1000μ g/

13、ml組與1μ g/ml組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05);重組組細(xì)胞FHITmRNA相對表達(dá)量同樣呈上升趨勢，各實驗組與對照組相比均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05);相同葉酸濃度下，重組組細(xì)胞的FHITmRNA相對表達(dá)量較未轉(zhuǎn)染組和空質(zhì)粒組的高，且差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。(5) C33A細(xì)胞，三組均隨著葉酸濃度的增加，F(xiàn)HIT蛋白表達(dá)量上升，未轉(zhuǎn)染組和重組組在葉酸濃度為250μ g/ml、500μ g/ml和1000μ g/m

14、l時，與1μ g/ml組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05);空質(zhì)粒組中500μ g/ml和1000μ g/ml組與1μ g/ml組相比有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。Caski細(xì)胞中，未轉(zhuǎn)染組與空質(zhì)粒組在500μ g/ml和1000μ g/ml組，F(xiàn)HIT蛋白表達(dá)量與對照組(1μ g/ml)相比有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。而在葉酸濃度為250μ g/ml、500μ g/ml和1000μ g/ml時，重組組細(xì)胞FHIT蛋白表達(dá)量與1μ

15、g/ml組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。相同葉酸濃度下，除C33A細(xì)胞250μ g/ml組和Caski細(xì)胞10μ g/ml組外，重組組FHIT蛋白相對表達(dá)量較未轉(zhuǎn)染組和空質(zhì)粒組的高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。(6)葉酸干預(yù)、DNMT1干擾對宮頸癌Caski細(xì)胞HPV16E6癌基因無明顯影響;三個組中E7mRNA的表達(dá)水平均隨著葉酸濃度的增加，表達(dá)降低。
　　 結(jié)論:
　　 1.高濃度葉酸可抑制DNMT1表

16、達(dá);使FHIT基因發(fā)生去甲基化，F(xiàn)HIT蛋白恢復(fù)表達(dá)。
　　 2.DNMT1基因可影響FHIT基因的甲基化狀態(tài)及表達(dá)。
　　 3.補(bǔ)充葉酸、DNMT1表達(dá)降低對宮頸癌細(xì)胞的生長增殖抑制具有協(xié)同作用。
　　 4.補(bǔ)充葉酸、DNMT1表達(dá)降低可使宮頸癌細(xì)胞FHIT基因發(fā)生去甲基化并恢復(fù)表達(dá)，二者具有協(xié)同作用;DNMT1干擾后再施加葉酸干預(yù)，F(xiàn)HIT基因表達(dá)水平進(jìn)一步升高，提示葉酸可能通過降低DNMT1表達(dá)水平而使FH