?；撬釋?duì)宮頸癌細(xì)胞自噬與凋亡的影響.pdf

1、目的：
　　1.觀察?；撬釋?duì)人宮頸癌細(xì)胞凋亡的影響及其初步機(jī)制。
　　2.觀察?；撬釋?duì)人宮頸癌細(xì)胞自噬的影響及其初步機(jī)制。
　　方法：
　　1.MTT法檢測(cè)Tau（0 mM,20 mM,40 mM,80 mM,160 mM,320 mM）分別處理宮頸癌細(xì)胞系HeLa及SiHa24 h,48 h,72 h后對(duì)細(xì)胞存活率的影響，以明確其劑量-效應(yīng)關(guān)系。
　　2.采用Western blotting法檢測(cè)Tau（

2、0 mM,20 mM,40 mM,80 mM,160 mM）及CQ20μM分別處理宮頸癌細(xì)胞系HeLa和SiHa48 h后，凋亡相關(guān)蛋白MST1、Bax、Bcl-2和自噬相關(guān)蛋白 LC3-II,LC3-I,Beclin1變化，評(píng)價(jià)Tau對(duì)凋亡和自噬的影響。
　　3.采用RT-qPCR檢測(cè)Tau（0 mM,20 mM,40 mM,80 mM,160 mM）及CQ20μM分別處理宮頸癌細(xì)胞系HeLa和SiHa48 h后，MST1,Ba

3、x,Bcl-2,Caspase-3凋亡相關(guān)mRNA及AKT,Beclin1自噬相關(guān)mRNA的表達(dá)水平，評(píng)價(jià)Tau對(duì)凋亡和自噬的影響。
　　4.收集細(xì)胞并用PBS沖洗,采用Annexin V-FITC/PI雙染色細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒檢測(cè)Tau（0 mM,20 mM,40 mM,80 mM,160 mM）,CQ20μM及高表達(dá)MST1基因?qū)iHa細(xì)胞凋亡的影響。
　　5.用Tau（0 mM,40 mM）處理對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期HeLa細(xì)胞

4、48 h后，單丹磺酰尸胺（MDC）熒光染色觀察自噬泡的形成。
　　6.將GFP-RFP-LC3質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HeLa和SiHa細(xì)胞，用熒光顯微鏡觀察Tau（0 mM,20 mM,40 mM,80mM,160 mM），CQ20μM處理48 h后細(xì)胞內(nèi)綠色熒光斑點(diǎn)和紅色熒光斑點(diǎn)的聚集情況檢測(cè)自噬水平。
　　結(jié)果：
　　1.MTT法顯示Tau對(duì)人宮頸癌細(xì)胞系HeLa和SiHa具有增殖抑制作用，并呈時(shí)間-劑量依賴性，Tau對(duì)人宮頸癌

5、細(xì)胞系HeLa和SiHa增殖抑制作用明顯增加(P＜0.01)。計(jì)算Tau作用人宮頸癌細(xì)胞系HeLa和SiHa后的IC50值發(fā)現(xiàn)，Tau對(duì)HeLa細(xì)胞的增殖抑制能力大于SiHa細(xì)胞。
　　2.Western Blot顯示在HeLa細(xì)胞中，Tau40 mM組相對(duì)其它濃度組能夠顯著升高M(jìn)ST1蛋白表達(dá)(P＜0.01)，在SiHa細(xì)胞中，MST1蛋白表達(dá)隨著Tau濃度逐漸升高而升高。2種細(xì)胞的Bcl-2蛋白表達(dá)均隨著Tau濃度逐漸升高而降

6、低(P＜0.01)，Bax蛋白表達(dá)均隨著Tau濃度逐漸升高而升高(P＜0.05)。而對(duì)自噬標(biāo)志性蛋白LC3和Beclin1的表達(dá)情況，2種細(xì)胞Beclin1蛋白表達(dá)均隨著Tau濃度逐漸升高而降低(P＜0.01)，胞漿型 LC3(即LC3-I)轉(zhuǎn)變?yōu)樽允审w膜型LC3(即LC3-II)隨著Tau濃度逐漸升高而減少，LC3-II\LC3-I比值減少(P＜0.01)。
　　3. RT-qPCR顯示在HeLa和SiHa細(xì)胞中，Bax和MST

7、1的表達(dá)顯著上調(diào)(P＜0.01)，Caspase-3稍有上調(diào)(P＜0.05)，Bcl-2的表達(dá)顯著下調(diào)(P＜0.01)，AKT的表達(dá)顯著上調(diào)(P＜0.01)，Beclin1的表達(dá)顯著下調(diào)(P＜0.01)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　4.高濃度Tau誘導(dǎo)凋亡SiHa細(xì)胞凋亡。體外介導(dǎo)p-EGFP-MST1質(zhì)粒轉(zhuǎn)入SiHa細(xì)胞凋亡率升高，與?；撬幔?60 mM）聯(lián)合處理時(shí)，細(xì)胞凋亡率的升高更明顯（P＜0.01）
　　5.MDC可被

8、細(xì)胞吸收并選擇性地結(jié)合到自噬囊泡膜上,使自噬泡在熒光顯微鏡下呈現(xiàn)為黃綠色或深綠色點(diǎn)狀結(jié)構(gòu)。Tau40 mM MDC陽(yáng)性細(xì)胞的熒光強(qiáng)度及細(xì)胞內(nèi)MDC熒光顆粒數(shù)目較Control組明顯減少，提示Tau能抑制HeLa和SiHa細(xì)胞自噬。
　　6.在HeLa和SiHa細(xì)胞中Tau處理組較Control組、CQ20μM組綠色熒光斑點(diǎn)和紅色熒光斑點(diǎn)的數(shù)量明顯減少，提示Tau能抑制HeLa和SiHa細(xì)胞自噬。
　　結(jié)論：
　　1.T