IL-27基因修飾人樹突狀細(xì)胞(DC)疫苗(IL-27-DC)的抗腫瘤作用研究.pdf

1、目的:乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤,嚴(yán)重影響著婦女的身心健康。近年來,生物治療已成為腫瘤治療的一種新模式,其中免疫基因治療是腫瘤生物治療的研究熱點(diǎn),通過將不同免疫分子基因?qū)肽[瘤或免疫效應(yīng)細(xì)胞,使其在機(jī)體表達(dá)并分泌有活性的細(xì)胞因子,促使腫瘤細(xì)胞的凋亡或通過增強(qiáng)免疫系統(tǒng)功能,以加速腫瘤的消退。白細(xì)胞介素27(IL-27)是2002年P(guān)flanz報(bào)道的一種IL-6/IL-12家族細(xì)胞因子[1],作用于固有免疫和適應(yīng)性免疫系統(tǒng)的多種細(xì)胞,發(fā)揮

2、廣泛的免疫調(diào)節(jié)作用。IL-27除在Th1反應(yīng)中起重要作用外,還具有抗感染、誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)等多種生物學(xué)活性[2]。樹突狀細(xì)胞(dendritic cells,DC)是機(jī)體功能最強(qiáng)的專職抗原提呈細(xì)胞,能高效地?cái)z取、加工處理和提呈抗原,具有較強(qiáng)的遷移能力,并能激活初始T細(xì)胞,處于啟動(dòng)、調(diào)控和維持免疫應(yīng)答的中心環(huán)節(jié)[3-4]。本實(shí)驗(yàn)將IL-27基因轉(zhuǎn)染人外周血來源的DC,制備IL-27/DC疫苗,觀察其對(duì)乳腺癌細(xì)胞的殺傷活性,為抗乳腺癌免疫治療提

3、供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　 方法:
　　 1建立轉(zhuǎn)染IL-27基因的DC疫苗(IL-27/DC)首先,分離、培養(yǎng)人外周血DC并誘導(dǎo)其成熟,用光學(xué)顯微鏡觀察成熟DC細(xì)胞的形態(tài),流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)及比較成熟與未成熟DC細(xì)胞的表型及成熟狀況;將攜帶IL-27基因的逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)染成熟DC細(xì)胞,用光學(xué)顯微鏡觀察DC、IL-27/DC細(xì)胞的形態(tài)變化,RT-PCR法檢測(cè)IL-27/DC、DC中IL-27 mRNA表達(dá)水平,ELISA法檢測(cè)IL-

4、27/DC培養(yǎng)上清中IL-27含量。
　　 2 IL-27誘導(dǎo)干擾素(IFN-γ)水平分析ELISA法檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清誘導(dǎo)人外周血單個(gè)核細(xì)胞(human peripheral blood mononuclear cells,hPBMCs)產(chǎn)生IFN-γ和IL-4水平。
　　 3淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)從人外周血分離和培養(yǎng)T細(xì)胞:用MTT法檢測(cè)DC、IL-27/DC分別對(duì)T細(xì)胞增殖能力的刺激作用,并繪制生長(zhǎng)曲線。
　　 4

5、細(xì)胞毒性T細(xì)胞(cytotoxic T lymphocyte,CTL)殺傷效應(yīng)檢測(cè)MTT法檢測(cè)DC、IL-27/DC疫苗活化的CTL在體外殺傷乳腺癌細(xì)胞4T1的活性。
　　 5動(dòng)物模型的建立[5]及IL-27/DC體內(nèi)抗腫瘤活性研究把BALB/c小鼠隨機(jī)分成三組,分別接種疫苗IL-27/DC、DC于小鼠皮下,未接種細(xì)胞小鼠作為對(duì)照組。兩周之后,于三組小鼠皮下接種乳腺癌細(xì)胞4T1,觀察、比較其在小鼠體內(nèi)的成瘤性、生長(zhǎng)情況和小鼠的生

6、存期。ELISA法檢測(cè)各組小鼠脾細(xì)胞分泌IFN-γ的能力。
　　 結(jié)果:
　　 1從外周血分離、誘導(dǎo)的成熟DC與未成熟DC比較,高表達(dá)CD80、CD86分子。將攜帶IL-27基因的逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)染人DC,獲得表達(dá)IL-27的IL-27/DC。光鏡下觀察,轉(zhuǎn)染IL-27基因后,與成熟DC細(xì)胞形態(tài)學(xué)無明顯差異;RT-PCR分析結(jié)果顯示,IL-27/DC細(xì)胞有IL-27p28和IL-27EBI3表達(dá),而野生型成熟DC細(xì)胞未見IL

7、-27p28和IL-27EBI3表達(dá);ELISA法檢測(cè)結(jié)果顯示,IL-27/DC細(xì)胞培養(yǎng)上清中可檢測(cè)出高水平IL-27,而DC細(xì)胞未檢出IL-27。該結(jié)果提示從基因和蛋白水平證明,成功建立了轉(zhuǎn)染IL-27基因的人DC疫苗。
　　 2 IL-27/DC細(xì)胞培養(yǎng)上清可刺激hPBMCs產(chǎn)生IFN-γ,IFN-γ水平明顯高于DC細(xì)胞(P＜0.01),然而,兩種細(xì)胞產(chǎn)生的IL-4水平無顯著性差異(P＞0.05)。
　　 3 IL-

8、27/DC細(xì)胞組刺激自體T淋巴細(xì)胞增殖,與DC細(xì)胞組相比差異顯著,有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　 4在不同效靶比條件下,IL-27/DC細(xì)胞均能增強(qiáng)CTL對(duì)4T1細(xì)胞的殺傷活性,其殺傷能力與效應(yīng)細(xì)胞數(shù)量成正比,顯著高于DC組(P＜0.05)。
　　 5在接種IL-27/DC疫苗小鼠組中,4T1細(xì)胞的生長(zhǎng)速度較接種DC和未接種細(xì)胞組明顯減慢(P＜0.01),且接種IL-27/DC疫苗組荷瘤小鼠的生存期也明顯長(zhǎng)于接種D