Ag85A基因修飾的樹突狀細胞疫苗抗膀胱癌的實驗研究.pdf

1、實驗目的：
　　 膀胱癌是泌尿系統(tǒng)最常見的腫瘤。膀胱腫瘤的發(fā)生和復發(fā)主要與機體免疫功能低下、腫瘤細胞逃逸機體的免疫監(jiān)視有關，如何提高膀胱腫瘤患者的免疫功能成為治療和預防膀胱腫瘤復發(fā)的關鍵，因而腫瘤的免疫治療方法越來越受關注。腫瘤特異性免疫治療的基礎是腫瘤細胞具有抗原性并能引起機體的免疫應答?？鼓[瘤免疫主要是T細胞介導的細胞免疫，有效的抗原提呈，是機體抗腫瘤免疫的始動因素。腫瘤細胞由于MHC-Ⅰ類分子表達低下及共刺激分子的缺乏，導

2、致自身提呈抗原能力低下，腫瘤特異性T細胞的激活必需依賴于抗原提呈細胞的幫助。樹突狀細胞(Dendritic cell DC)是體內(nèi)唯一能夠激活初始T細胞的抗原提呈細胞，是啟動、調(diào)控并維持免疫應答的重要環(huán)節(jié)。有研究表明，惡性腫瘤細胞在患者體內(nèi)釋放的免疫抑制因子能抑制DC的生物學活性，使其不能有效提呈腫瘤抗原激發(fā)機體的抗腫瘤免疫，導致腫瘤細胞的逃逸。更有實驗證實在膀胱腫瘤組織中浸潤的DC成熟受抑，共刺激分子CD80、CD86的表達下調(diào)，可能

3、是其發(fā)生免疫逃逸的機制之一。因此研究以DC為基礎的DC疫苗免疫治療方法將成為膀胱腫瘤治療和預防復發(fā)的有效手段。
　　 制備DC疫苗的基本方法是將腫瘤抗原負載DC。而DC疫苗有效性的首要前提是DC具有正常的生物學功能。促進DC的成熟、增強其功能則是提高DC疫苗免疫效果的重要手段。將細胞因子基因?qū)隓C或通過細菌DNA序列CpG刺激、HSP沖激DC等方法均能促進DC的成熟，從而促進其抗原提呈功能，提高DC疫苗免疫效果。Morales

4、將BCG經(jīng)膀胱灌注用于膀胱癌的治療取得了成功。Tokunaga等發(fā)現(xiàn)從BCG中提取的DNA片段具有抗腫瘤活性。研究還發(fā)現(xiàn)從BCG中提取的Ag85復合物具有較強的免疫刺激活性。其中Ag85ADNA疫苗可刺激機體Th1型細胞因子IL-2、IFN-γ、TNF-α等的產(chǎn)生水平升高；促進細胞毒性T細胞(CTL)的細胞毒活性，增強NK細胞、單核-巨噬細胞的腫瘤殺傷活性。Ag85A基因轉染的DC疫苗已用于抗結核的實驗研究，但以此轉染的DC疫苗用于膀胱

5、癌的研究國內(nèi)外尚無報道。本研究構建了Ag85A真核表達載體，將其轉染小鼠樹突狀細胞株DC2.4，觀察Ag85A基因轉染的DC免疫生物學特性的變化，并以Ag85A基因修飾的DC2.4負載膀胱腫瘤抗原制備DC疫苗，觀察其在體內(nèi)外對膀胱腫瘤的免疫學效應。
　　 實驗方法：
　　 1、重組質(zhì)粒pcDNA3.1/myc-hisA-Ag85A的構建及轉化經(jīng)PCR擴增的目的基因Ag85A與載體pcDNA3.1/myc-hisA連接后轉

6、化到大腸桿菌E.coli DH5α，提取質(zhì)粒經(jīng)酶切電泳鑒定和測序證實。
　　 2、重組質(zhì)rpcDNA3.1/myc-hisA-Ag85A轉染DC2.4采用lipofectamine2000進行pcDNA3.1/myc-hisA-Ag85A重組質(zhì)粒轉染DC2.4，同時設pcDNA3.1/myc-hisA空質(zhì)粒轉染和未轉染DC2.4作為對照。48h后收獲瞬時轉染細胞。瞬時轉染48小時后按篩選試驗中所確定的最佳G418濃度(500μg

7、/ml)加入G418進行穩(wěn)定轉染細胞的篩選，持續(xù)篩選3周后獲穩(wěn)定轉染細胞株，即DC-Ag85A、DC-pcDNA。
　　 3、RT-PCR法檢測瞬時及穩(wěn)定轉染DC中Ag85A mRNA表達瞬時及穩(wěn)定轉染DC樣品抽提總RNA進行RT-PCR檢測Ag85A基因的mRNA表達。
　　 4、MTT法檢測轉染DC刺激T細胞增殖能力轉染pcDNA3.1/myc-hisA-Ag85A重組質(zhì)粒、pcDNA3.1/myc-hisA空質(zhì)粒和

8、未轉染的DC2.4細胞，加入絲裂霉素C滅活，調(diào)整細胞濃度為4×105/ml，作為刺激細胞。制備C57BL/6小鼠脾細胞懸液，紅細胞裂解液溶解紅細胞，尼龍毛柱分離T淋巴細胞，調(diào)整細胞濃度為2×106/ml，作為反應細胞。在96孔細胞培養(yǎng)板中，每孔加入反應細胞和刺激細胞各100μl，分別于37℃、5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h、48h、72h和96h，MTT法檢測。
　　 5、流式細胞術檢測轉染DC膜表面CD80、CD86和MHC-Ⅱ

9、表達水平上述轉染的各組DC，調(diào)整細胞濃度至1×107/ml。取100μl細胞懸液加入到FACS測定管中，各管分別加入抗-CD80-PE單克隆抗體、抗-CD86-PE單克隆抗體、抗-MHCⅡ-PE單克隆抗體冰浴30 min，流式細胞儀檢測。
　　 6、MB49粗提抗原及負載腫瘤抗原DC疫苗的制備收集對數(shù)生長期的MB49細胞，反復凍融離心，取上清，制備粗提抗原。將穩(wěn)定轉染的DC-Ag85A、DC-pcDNA和DC2.4接種于6孔細胞

10、培養(yǎng)板，然后加入MB49粗提抗原，37℃、5%CO2培養(yǎng)48h負載抗原。制成DC-Ag85A疫苗、DC-pcDNA疫苗和DC2.4疫苗。
　　 7、MTT法檢測DC疫苗刺激的效應T細胞對MB49細胞的細胞毒效應上述DC疫苗及未負載腫瘤抗原的DC2.4細胞，加入絲裂霉素C，37℃30min滅活。滅活的DC按照1:10的比例與分離的C57BL/6小鼠脾T淋巴細胞共培養(yǎng)，并以未經(jīng)DC刺激的T淋巴細胞作為對照。培養(yǎng)72h收集懸浮細胞即為

11、DC疫苗刺激的效應T細胞。以對數(shù)生長期的MB49細胞作為靶細胞，濃度為4×105/ml。按效：靶等于10:1加入96孔板，同時以單純效應細胞和單純靶細胞作對照，培養(yǎng)72h，MTT法檢測。
　　 8、ELISA檢測負載腫瘤抗原DC疫苗刺激的效應T細胞分泌IFN-γ水平采用ELISA法對上述各組DC疫苗刺激的效應細胞上清IFN-γ的含量進行檢測，酶標儀檢測450nm處OD值，應用SoftMax Pr04.3.1 LS軟件分析，繪制標

12、準品曲線，計算樣品中IFN-γ的含量。
　　 9、MB49皮下移植瘤動物模型的建立和分組及其免疫MB49細胞1×107/ml，第0天注射1×106細胞于待實驗的C57BL/6小鼠背部皮下。24只小鼠共分為4組，即DC-Ag85A疫苗組、DC-pcDNA疫苗組、DC2.4疫苗組和PBS對照組，每組6只，雌雄各半，分別在接種腫瘤細胞后的第1、7和14天于每只小鼠的接種腫瘤部位局部注射DC-Ag85A疫苗、DC-pcDNA疫苗、DC2

13、.4疫苗和PBS0.1ml，DC細胞數(shù)為1×106。
　　 10、腫瘤生長情況的檢測接種后每天觀察腫塊的形成情況，記錄潛伏期。第21天處死小鼠剝離腫瘤，測量腫塊的長徑a和短徑b，計算腫瘤體積。同時稱取腫瘤重量。分別計算重量和體積抑瘤率。
　　 11、腫瘤組織切片病理學檢查剝離小鼠皮下腫瘤組織做常規(guī)組織切片，H-E染色，光鏡觀察組織病理學改變。
　　 12、免疫組化分析腫瘤組織中浸潤T細胞亞群上述組織切片用抗-CD

14、4和抗-CD8單克隆抗體進行免疫組化染色，分析腫瘤組織中浸潤T細胞亞群。
　　 13、流式細胞儀檢測荷瘤小鼠脾T細胞亞群取各組小鼠脾臟制備脾細胞懸液，調(diào)整細胞濃度為1×107/ml。每份樣品用抗-CD4-FITC單克隆抗體和抗-CD69-PE單克隆抗體進行雙色染色分析，另設陰性對照管。流式細胞儀檢測。
　　 14、ELISA檢測荷瘤小鼠脾細胞培養(yǎng)上清IFN-γ水平采用ELISA法對上述各組小鼠脾細胞培養(yǎng)上清IFN-γ的含

15、量進行檢測，酶標儀檢測450nm處OD值，應用SoftMax Pro4.3.1 LS軟件分析，繪制標準品曲線，計算樣品中IFN-γ的含量。
　　 實驗結果：
　　 1、重組質(zhì)粒構建及轉化從轉化后的E.coli DH5α中提取pcDNA3.1/myc-hisA-Ag85A重組質(zhì)粒，酶切電泳鑒定質(zhì)粒中存在Ag85A基因片段，經(jīng)測序與GenBank中序列完全一致。
　　 2、RT-PCR法檢測瞬時及穩(wěn)定轉染DC中Ag8

16、5A mRNA表達結果顯示瞬時及穩(wěn)定轉染pcDNA3.1/myc-hisA-Ag85A重組質(zhì)粒的DC2.4，均有Ag85A的mRNA表達。
　　 3、轉染DC刺激小鼠T淋巴細胞增殖DC-Ag85A刺激T細胞增殖的能力隨培養(yǎng)時間的增加而增強，72h達高峰，96h開始下降。DC-Ag85A在48h和72h時的刺激指數(shù)(SI值)分別為10.61±1.06和16.80±2.23，均顯著高于DC-pcDNA(5.90±0.80和7.56±

17、0.57)和DC2.4(7.40±0.88和10.75±0.68)對照組，差異顯著。
　　 4、轉染DC膜表面分子的變化結果顯示，DC-Ag85A膜表面CD80、CD86及MHC-Ⅱ分子的表達率分別為54.05±2.46%、65.29±2.03%和47.83±1.78%，均高于DC-pcDNA(27.87±1.51%、49.43±1.23%和14.49±0.91%)和DC2.4對照組(27.01±0.69%，39.43±3.42

18、%和15.39±1.28%)，差異顯著。
　　 5、DC疫苗刺激的脾T細胞對MB49細胞的細胞毒效應DC-Ag85A疫苗刺激的脾T細胞對MB49的細胞毒效應(73.88±4.64%)高于DC-pcDNA疫苗和DC2.4疫苗組(51.25±6.75%和54.50±5.31%)，也高于未負載腫瘤抗原的DC2.4(47.03±3.83%)及單純T細胞對照組(41.73±7.44%)，差異顯著。
　　 6、DC疫苗刺激的脾T細胞

19、鄉(xiāng)泌IFN-γ的水平結果顯示，DC-Ag85A疫苗刺激的脾T細胞分泌IFN-γ水平(270.05±33.56pg/ml)顯著高于DC-pcDNA疫苗(93.69±6.30pg/ml)和DC2.4疫苗組(102.14±16.95pg/ml)，也顯著高于未負載腫瘤抗原的DC2.4(5.72±0.99 pg/ml)及單純脾T細胞對照組(6.31±1.64 pg/ml)，差異顯著。
　　 7、荷瘤鼠腫瘤生長情況與PBS對照組相比，DC-

20、Ag85A疫苗組腫瘤形成潛伏期延長(13.33±2.875d)，腫瘤體積(2.32±0.92cm3)和腫瘤重量(2.16±0.91g)明顯降低。DC-Ag85A疫苗組、DC-pcDNA疫苗組和DC2.4疫苗組對腫瘤體積和腫瘤重量的抑瘤率分別為51.76%和54.43%、23.28%和28.48%、25.36%和26.79%。
　　 8、腫瘤組織病理學觀察DC-Ag85A疫苗組有大量炎性細胞浸潤，其它疫苗組和PBS組均僅見少量炎性

21、細胞浸潤。
　　 9、腫瘤組織中浸潤T細胞亞群結果顯示，DC-Ag85A疫苗組浸潤CD4+和CD8+T細胞亞群(23.96±4.18個/HP和28.07±4.74個/HP)顯著高于PBS對照組(3.39±1.23個/HP和6.22±3.36個/HP)；也高于DC-pcDNA疫苗組(17.66±2.23個/HP和14.27±3.11個/HP)和DC2.4疫苗組(15.45±2.34個/HP和12.56±3.15個/HP)。

22、　　 10、荷瘤鼠脾T細胞亞群的變化DC-Ag85A疫苗組小鼠脾臟CD4+T和CD4+CD69+T細胞數(shù)量分別為22.77±3.95%和8.24±1.42%顯著高于PBS對照組(17.42±4.27%和3.97±0.79%)。DC-Ag85A疫苗組CD4+CD69+T細胞數(shù)量(8.24±1.42%)顯著高于DC-pcDNA疫苗(3.71±0.95%)、DC2.4疫苗組(3.98±0.91%)和PBS對照組(3.97±0.79%)。

23、r>　　 11、荷瘤鼠脾細胞培養(yǎng)上清IFN-γ水平DC-Ag85A疫苗組脾細胞培養(yǎng)上清中IFN-γ水平(430.59±53.41 pg/ml)顯著高于DC-pcDNA(110.89±16.58 pg/ml)、DC2.4疫苗組(119.95±30.84 pg/ml)和PBS對照組(5.49±0.63 pg/ml)。
　　 結論：
　　 1、重組質(zhì)粒pc-DNA3.1/myc-his-Ag85A成功轉染DC2.4，建立了有

24、Ag85AmRNA穩(wěn)定表達的DC細胞株。
　　 2、Ag85A基因轉染可增強DC2.4膜表面分子MHC-Ⅱ、CD80和CD86的表達，促進DC2.4的成熟及其對刺激T淋巴細胞增殖的能力。提示轉染Ag85A基因可能會提高DC的抗原提呈能力。
　　 3、負載膀胱腫瘤抗原的Ag85A基因修飾的DC疫苗，可體外刺激效應T細胞對膀胱腫瘤細胞系的細胞毒作用增強和IFN-γ的分泌水平升高，提示該疫苗具有增強抗膀胱腫瘤效應。