大鼠精原干細胞的長期培養(yǎng)、鑒定及其特異標(biāo)記基因表達載體的構(gòu)建.pdf

1、在雄性哺乳動物睪丸內(nèi)持續(xù)的精子發(fā)生是維持其生殖能力的必備條件。精原干細胞(SpermatogonialStemCells，SSCs)是精子發(fā)生的基礎(chǔ)，既可以逐級分化最終產(chǎn)生有功能的成熟精子，又可以自我更新維持其干細胞的數(shù)量。體外對SSCs進行分離純化、培養(yǎng)及其它操作技術(shù)的建立為精子發(fā)生過程、雄性輔助生殖、細胞再生治療和遺傳學(xué)的研究開辟了新的道路。鑒于SSCs具有多種潛能和應(yīng)用前景，極具研究價值，本研究對大鼠SSCs進行了系統(tǒng)且完整的分離

2、純化、長期培養(yǎng)以及體外分化能力的研究。之所以選擇大鼠為研究對象是因為大鼠作為模式動物，能為哺乳動物SSCs的特性和機理研究提供更多便利和資料。此外，大鼠還具有其他優(yōu)勢，如大小、繁殖力、易于手術(shù)處理、取樣方便和便于實驗管理等，使其成為特別有吸引力的動物模型，將為人類健康和疾病的研究提供更多的生理及臨床研究數(shù)據(jù)。此外，構(gòu)建可在睪丸SSCs中特異表達熒光蛋白標(biāo)記的質(zhì)粒載體，將能夠很方便地辨認SSCs，使得SSCs在體內(nèi)外關(guān)于增殖和分化的動態(tài)變

3、化直觀地表現(xiàn)出來，這將大大便利于SSCs的特性和功能的研究。為此，本研究制備了在睪丸SSCs中特異表達紅色熒光蛋白的質(zhì)粒載體，若能聯(lián)合精原干細胞移植技術(shù)，制備轉(zhuǎn)基因大鼠，預(yù)計該轉(zhuǎn)基因大鼠將在SSCs中特異表達紅色熒光蛋白，為后續(xù)SSCs體內(nèi)外的研究提供實用的細胞模型和動物模型。
　　 1.大鼠精原干細胞的分離和純化
　　 本研究以22-25天Wistar-Iamichi大鼠為研究對象，利用兩步酶消化法分離得到睪丸曲細精管

4、細胞懸液，根據(jù)精原干細胞與曲細精管細胞懸液中體細胞(支持細胞及少量的管周細胞)及各級分化的生精細胞貼壁能力及對細胞外基質(zhì)粘附力的不同，將大鼠精原干細胞進行純化。經(jīng)純化后5只大鼠的睪丸約可以得到3×105個SSCs。利用該方法分離和純化大鼠SSCs，操作簡便，且得到的SSCs具有很高的活力和增殖能力，是一種高效的分離純化方法。
　　 2.大鼠精原干細胞的體外長期培養(yǎng)
　　 本研究建立了大鼠SSCs體外長期培養(yǎng)系統(tǒng)，該系統(tǒng)以

5、絲裂霉素處理的STO(SIMmouseembryo-derivedthioguanineandouabainresistant)細胞為滋養(yǎng)層，使用無血清、培養(yǎng)成分明確的培養(yǎng)液，添加GDNF(basicfibroblastgrowthfactor)，bFGF(glialcellline-derivedneurotrophicfactor)，GFRα1(GDNF-familyreceptorα1)三個重要生長因子。在該培養(yǎng)體系中，大鼠SSC

6、s連續(xù)培養(yǎng)超過6個月，傳代超過30代，葡萄串狀的SSCs細胞克隆形態(tài)保持不變。該SSCs可在體外任意培養(yǎng)時期進行冷凍保存，解凍后可迅速恢復(fù)生長。該體系的穩(wěn)定建立，為日后大鼠SSCs的研究和應(yīng)用奠定了扎實的基礎(chǔ)。
　　 3.體外長期培養(yǎng)大鼠精原干細胞的鑒定
　　 本研究運用睪丸冰凍切片免疫熒光染色和曲細精管整段免疫熒光染色對大鼠睪丸內(nèi)SSCs的位置分布及形態(tài)進行了檢測，并證實實驗所用標(biāo)記基因CDH1，GFRαl，PLZF是

7、可靠的大鼠SSCs的標(biāo)記基因。對長期培養(yǎng)的大鼠SSCs進行分子水平的鑒定。經(jīng)細胞免疫熒光分析可見，培養(yǎng)的大鼠SSCs同時表達CDH1，GFRα1和PLZF三個SSCs標(biāo)記基因的蛋白質(zhì)產(chǎn)物。RT-PCR分析證實了CDH1，GFRα1，PLZF在長期培養(yǎng)的大鼠SSCs中轉(zhuǎn)錄表達，同時還證實了其他SSCs標(biāo)記基因c-kit，POU5f1，C-Ret的轉(zhuǎn)錄表達。該鑒定技術(shù)簡便、可靠，可用來鑒定體外長期培養(yǎng)的SSCs，為日后SSCs的后續(xù)研究奠定

8、了基礎(chǔ)，并為家畜等大動物SSCs體外鑒定提供了借鑒。
　　 4.大鼠精原干細胞體外分化功能的鑒定
　　 在該體系中，體外長期培養(yǎng)的大鼠精原干細胞與睪丸體細胞共培養(yǎng)，采用MEMα+10％FBS培養(yǎng)液，并添加促卵泡激素(FSH)和睪酮，在34℃，5%CO2和飽和濕度條件下進行體外分化培養(yǎng)。該培養(yǎng)體系在開始培養(yǎng)的24h之內(nèi)，精原細胞大量死亡，之后逐漸穩(wěn)定，培養(yǎng)兩周左右的時間可以觀察到精母細胞，培養(yǎng)三周后可觀察到體積較小的精子細

9、胞。該研究證實體外長期培養(yǎng)的大鼠SSCs是有生理功能的，同時該體系的建立也為在體外深入進行大鼠精子發(fā)生研究奠定了基礎(chǔ)。
　　 5.SSCs特異標(biāo)記基因表達載體的構(gòu)建
　　 該載體采用CDH1啟動子。CDH1已經(jīng)被證實是小鼠和大鼠SSCs的標(biāo)記分子。本研究采用無啟動子的基礎(chǔ)載體pDsRed2-1，在其多克隆位點插入CDH1啟動子驅(qū)動紅色熒光蛋白基因DsRed2的表達，在其相反方向插入了CMV-EGFP基因表達框，期待轉(zhuǎn)染細