骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞復(fù)合異種骨在兔體內(nèi)的再血管化和成骨研究.pdf

1、目的： 近年來組織工程學(xué)的迅速發(fā)展使得利用其原理和方法再生組織或器官的特點(diǎn)和優(yōu)勢得到廣泛認(rèn)同。作為組織工程研究的重要領(lǐng)域，骨組織工程研究在多方面均取得了令人振奮的研究成果，并已在臨床得到初步應(yīng)用，被認(rèn)為是組織工程中最具有前途和可行性的領(lǐng)域之一。本課題根據(jù)骨組織工程學(xué)的基本原理，設(shè)計(jì)將骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞與帶部分松質(zhì)骨的小牛皮質(zhì)骨板復(fù)合，植入新西蘭大白兔髂骨內(nèi)觀察其成骨及再血管化情況，為構(gòu)建理想的初步組織工程骨工程化產(chǎn)品提供理論依據(jù)。

2、 方法： 1.兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的分離、培養(yǎng)和鑒定 取新西蘭大白兔骨髓，采用密度梯度離心法并結(jié)合傳代獲取、純化細(xì)胞，觀察細(xì)胞形態(tài)和表面標(biāo)志物的表達(dá)，從而對其鑒定。MTT法測定第3、6代細(xì)胞的增殖情況，并繪制出生長曲線。 2.兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的誘導(dǎo)成骨研究 取生長良好的傳三代細(xì)胞，用成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基進(jìn)行誘導(dǎo)，觀察細(xì)胞形態(tài)，并分別于培養(yǎng)的第2天、第4天、第6天、第8天、第10天、第12天、第14天收集

3、細(xì)胞，進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)堿性磷酸酶含量測定；于誘導(dǎo)7天時(shí)行I型膠原免疫細(xì)胞化學(xué)染色，于誘導(dǎo)14天行骨鈣素免疫細(xì)胞化學(xué)染色，于誘導(dǎo)21天時(shí)行鈣化結(jié)節(jié)染色；取傳第三代，誘導(dǎo)7天，誘導(dǎo)14天，誘導(dǎo)21天后的的細(xì)胞行RT-PCR檢測BMP-2，VEGF的mRNA含量和采用Western-blot檢測BMP-2，VEGF的蛋白含量。 3.兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞與小牛骨的生物相容性研究 取第三代細(xì)胞接種在帶部分松質(zhì)骨的小牛皮質(zhì)骨板上，接種后第4

4、、8、12、24小時(shí)取樣測定細(xì)胞的粘附率；將不同濃度的小牛骨浸提液與兔BMSCs體外培養(yǎng)2d，4d，7d，觀察細(xì)胞的形態(tài)變化并用MTT檢測，計(jì)算細(xì)胞的相對增殖度，用六級毒性分類進(jìn)行分級；BMSCs與小牛骨復(fù)合培養(yǎng)2周后，取材行掃描電鏡觀察細(xì)胞在材料表面的生長增殖和基質(zhì)分泌情況。 4.兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞復(fù)合小牛骨植入兔體內(nèi)的實(shí)驗(yàn)研究 (1)分別將兔BMSCs成骨誘導(dǎo)后復(fù)合的異種骨(I組)，單純異種骨(II組)，自體髂骨(Ⅲ

5、組)隨機(jī)植入兔髂骨。觀察各組植入物的表面變化及周圍組織反應(yīng)。 (2)術(shù)后4周，8周，12周，24周行X線片檢查，觀察X線片變化情況。 (3)術(shù)后4周，8周，12周，24周取材行HE染色及VEGF，BMP-2免疫組織化學(xué)染色觀察表達(dá)情況。 (4) RT-PCR檢測體內(nèi)各組術(shù)后4周，8周，12周，24周時(shí)VEGF，BMP-2的mRNA的表達(dá)情況。 結(jié)果： 1.經(jīng)密度梯度離心結(jié)合傳代所得到的細(xì)胞形態(tài)均一

6、，呈長梭形，接近融合狀態(tài)時(shí)可呈現(xiàn)旋渦樣生長，傳第10代細(xì)胞的增殖能力減弱，出現(xiàn)寬大梭形，排列紊亂。所分離的細(xì)胞表達(dá)CD44、CD29，僅約5％表達(dá)CD34。生長曲線顯示第3、6代細(xì)胞均有較強(qiáng)的增殖能力。 2.兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨誘導(dǎo)后，細(xì)胞形態(tài)由長梭形逐漸變?yōu)槎趟笮?，多角形，最后成集落層疊生長；在誘導(dǎo)過程中，ALP含量逐漸增高，與對照組比較有顯著性差異(P<0.05)；于誘導(dǎo)7天時(shí)I型膠原免疫細(xì)胞化學(xué)染色，誘導(dǎo)14天骨鈣素免疫

7、細(xì)胞化學(xué)染色，誘導(dǎo)21天時(shí)鈣化結(jié)節(jié)染色陽性；RT-PCR和Western-Blot結(jié)果顯示誘導(dǎo)組和對照組均有BMP-2和VEGF表達(dá)，誘導(dǎo)組于誘導(dǎo)后第7天，兩者表達(dá)最強(qiáng)。誘導(dǎo)組于誘導(dǎo)后第7天、第14天和第21天與對照組比較VEGF和BMP2表達(dá)有顯著差異(P<0.05)。 3.細(xì)胞接種4h，8h，12h，24h，細(xì)胞粘附率分別為47±4％，65±2％，77±3％，86±12％。不同濃度的小牛骨浸提液與兔BMSCs體外培養(yǎng)，細(xì)胞貼

8、壁生長，形態(tài)良好，隨著培養(yǎng)天數(shù)的增加細(xì)胞大量增殖，毒級為0-1級。BMSCs與小牛骨復(fù)合培養(yǎng)2周后行掃描電鏡觀察，細(xì)胞均在小牛骨表面生長，并可延入材料孔隙之中，有基質(zhì)分泌。 4.各組材料復(fù)合體植入兔髂骨后，傷口生長良好，沒有全身和局部的炎癥和毒性反應(yīng)，傷口一期愈合。X線顯示髂骨組在術(shù)后12周基本達(dá)到骨質(zhì)愈合，復(fù)合異種骨組在術(shù)后24周時(shí)與宿主骨結(jié)合部基本愈合，而單純異種骨組術(shù)后24周與宿主骨愈合不滿意。術(shù)后4周，8周，12周，24

9、周取材行HE染色可觀察到軟骨化骨過程，各時(shí)間點(diǎn)VEGF，BMP-2免疫組織化學(xué)染色陽性，陽性程度Ⅲ組>I組>II組。術(shù)后4、8、12、24周各組均可見BMP2、VEGF的mRNA表達(dá)，BMP2在I組、II組、Ⅲ組之間相比，各組相比P<0.05，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，即成骨能力：Ⅲ組>I組>II組。VEGF在II組與I組、II組與Ⅲ組之間相比，在各時(shí)間點(diǎn)P<0.05，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。I組與Ⅲ組在術(shù)后8、12、24周時(shí)比較P>0.05，無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

10、 結(jié)論： 1.兔BMSCs分離、提取操作簡便易行，且有較強(qiáng)的生長增殖能力，可誘導(dǎo)分化為成骨細(xì)胞，符合組織工程種子細(xì)胞的基本條件。其在成骨誘導(dǎo)過程中，BMP-2和VEGF表達(dá)均先增強(qiáng)后減弱，VEGF表達(dá)可能對血管生成有促進(jìn)作用。 2.帶部分松質(zhì)骨的小牛皮質(zhì)骨可作為骨組織工程中BMSCs的細(xì)胞載體，無毒，生物相容性好，基本滿足骨組織工程的需要。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)表明其是一種較為理想的骨組織工程支架材料，在組織相容性、力學(xué)性能及