肝再生增強因子免疫抑制作用與調(diào)節(jié)性T細胞的關(guān)系及相關(guān)機制研究.pdf

1、第一部分、肝再生增強因子對PBMC增殖的影響與調(diào)節(jié)性T細胞的關(guān)系
　　目的:肝再生增強因子(Augmenter of liver regeneration，ALR)具有免疫調(diào)節(jié)作用，但其發(fā)揮負性免疫調(diào)控作用的機制尚未明確。本部分課題擬通過觀察人肝再生增強因子(Human augmenter of liverregeneration，hALR)在體外對ConA刺激的正常人外周血單個核細胞(Peripheral blood monon

2、uclear cells，PBMC)的增殖和凋亡的影響以及對其中CD4+CD25+FoxP3+調(diào)節(jié)性T細胞(RegulatoryT cell，Treg)亞群分化增殖的影響，探討hALR免疫抑制作用的可能機制。
　　方法:以ConA刺激的健康人PBMC為實驗細胞，分別設(shè)Control組、ConA組和ConA+hALR組。體外培養(yǎng)60h后用MTS法檢測各組細胞增殖率，流式及免疫印跡法檢測各組細胞的早期細胞凋亡率及凋亡相關(guān)蛋白表達，實時

3、熒光定量PCR檢測各組FoxP3的表達，流式檢測各組細胞CD4+CD25+FoxP3+Treg的比例及細胞周期變化。
　　結(jié)果:hALR能夠明顯抑制ConA刺激的PBMC增殖（ConA組vs ConA+hALR組，P＜0.01），且hALR降低ConA引起的細胞凋亡(ConA組vs ConA+hALR組，P＜0.01)。hALR在抑制細胞增殖的同時，上調(diào)FoxP3基因的表達，提高Treg的比例(ConA組vs ConA+hALR組

4、，P＜0.01)，并且能夠解除ConA導(dǎo)致的Treg亞群細胞周期G2/M期阻滯（ConA組vs ConA+hALR組，P＜0.01）。
　　結(jié)論:hALR能夠顯著抑制ConA刺激的PBMC增殖，但不是通過誘導(dǎo)PBMC凋亡實現(xiàn)的，而是具有抗凋亡作用，hALR同時上調(diào)CD4+CD25+FoxP3+Treg的比例，提示hALR可能通過誘導(dǎo)Treg來抑制ConA刺激的PBMC增殖。
　　第二部分、肝再生增強因子誘導(dǎo)調(diào)節(jié)性T細胞發(fā)揮免

5、疫抑制作用的機制
　　目的:細胞因子在Treg的分化增殖及免疫抑制作用中發(fā)揮重要作用，本研究擬通過觀察hALR對各組細胞上清中細胞因子(TGF-β1、IL-10、IL-2)水平的影響，以及對各組細胞信號通路分子(ERK1/2、NF-κB)活性及表達的影響，探討hALR促進Treg分化增殖以及發(fā)揮免疫抑制作用的可能機制。
　　方法:以ConA刺激的健康人PBMC為實驗細胞，分別設(shè)Control組、ConA組和ConA+hALR

6、組。用ELISA方法分別檢測培養(yǎng)16h和40h各組細胞上清中TGF-β1、IL-10、IL-2的水平，用免疫印跡法檢測培養(yǎng)60h的各組細胞ERK1/2的活性和NF-κB(p65)的表達。
　　結(jié)果:hALR能夠顯著增加細胞培養(yǎng)上清中TGF-β1和IL-10的水平，降低IL-2的水平（ConA組vs ConA+hALR組，P＜0.01）。hALR能夠顯著抑制ERK1/2的活性和NF-κB(p65)的表達（ConA組vsConA+hA

7、LR組，P＜0.01）。
　　結(jié)論:hALR可以促進TGF-β1和IL-10產(chǎn)生而抑制IL-2產(chǎn)生，能夠抑制ERK1/2的活性和NF-κB(p65)的表達，提示hALR對細胞因子的調(diào)控可能既是hALR上調(diào)Treg的條件也是其發(fā)揮免疫抑制作用的機制，在分子機制上則表現(xiàn)為對信號通路分子的調(diào)控。
　　第三部分、肝再生增強因子對大鼠腹腔肝細胞移植免疫排斥的影響
　　目的:hALR體外能夠上調(diào)Treg并抑制ConA活化的免疫細胞

8、增殖，本部分研究擬通過觀察腹腔內(nèi)同種異體肝細胞移植(Hepatocytetransplantation，HCT)聯(lián)合hALR治療急性肝衰竭(Acute liver failure，ALF)大鼠的療效，以及hALR對大鼠免疫排斥反應(yīng)的影響，探討hALR體內(nèi)的免疫抑制作用及機制。
　　方法:以D-氨基半乳糖（D-galactosamine，D-GalN）誘導(dǎo)ALF的 S-D大鼠為動物模型，半原位膠原酶灌注法新鮮分離的大鼠肝細胞腹腔內(nèi)移

9、植聯(lián)合hALR治療ALF大鼠，分為生理鹽水(PS)組、HCT組、HCT+hALR組、hALR組。觀察各組大鼠生存率，組織學(xué)分析腹腔內(nèi)移植肝細胞存活情況，免疫組化檢測大網(wǎng)膜免疫細胞CD68、CD4、CD8及Foxp3陽性率，流式檢測腹腔內(nèi)大網(wǎng)膜免疫細胞中CD4+CD25+FoxP3+Treg的比例，實時熒光定量PCR檢測移植物周圍大網(wǎng)膜免疫細胞TGF-β1、IL-10 mRNA表達水平，ELISA檢測腹水及血清中TNF-α和IL-1β水平

10、。
　　結(jié)果:hALR聯(lián)合HCT治療能夠顯著提高大鼠生存率(P＜0.05)，且hALR明顯改善腹腔移植物存活情況，減少炎癥細胞浸潤。hALR明顯降低大網(wǎng)膜免疫細胞CD68、CD4、CD8陽性率，增加Foxp3陽性率，上調(diào)大網(wǎng)膜免疫細胞中Treg的比例和TGF-β1、IL-10 mRNA的表達，降低前炎癥介質(zhì)TNF-α和IL-1β水平（HCT組vs HCT+hALR組，P＜0.05）。
　　結(jié)論:hALR能夠通過上調(diào)腹腔HCT