紅活麻總香豆素免疫抑制作用及機(jī)制研究.pdf

1、目的：探討紅活麻總香豆素發(fā)揮免疫抑制作用的分子機(jī)制。通過(guò)觀察紅活麻總香豆素抗Ⅱ型膠原型關(guān)節(jié)炎(collagen-induced arthritis,CIA)大鼠的作用,明確其抗類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎作用及可能的分子機(jī)制;通過(guò)體外培養(yǎng)小鼠樹(shù)突狀細(xì)胞(DC),測(cè)定其表型(CD11c、CD86、MHC-Ⅱ)及功能(MLR反應(yīng))變化以及PD-L1抗體對(duì)紅活麻總香豆素影響DC細(xì)胞的逆轉(zhuǎn)作用,結(jié)合紅活麻總香豆素體內(nèi)對(duì)小鼠CD4+CD25+Foxp3+Treg

2、細(xì)胞分化和CTLA-4表達(dá)的影響,明確紅活麻總香豆素發(fā)揮免疫抑制作用的分子機(jī)制。
　　方法：(1)于Wistar大鼠左趾皮內(nèi)多點(diǎn)注射1ml的CⅡ乳劑(2mg/mlⅡ型膠原醋酸溶液與等量完全弗氏佐劑乳化制得),第21d于大鼠尾根部注射同等乳劑加強(qiáng)刺激,建立CIA模型。造模成功后大鼠隨機(jī)分6組:正常對(duì)照組、CIA模型組、紅活麻總香豆素小劑量(19mg/kg)組、紅活麻總香豆素中劑量(37.5mg/kg)組、紅活麻總香豆素大劑量(75m

3、g/kg)組、甲氨蝶呤(methotrexate,MTX)陽(yáng)性對(duì)照組,每組10只。大鼠于首次免疫后21d給藥組每日灌胃給于相應(yīng)劑量的紅活麻總香豆素,并記為給藥第0d,連續(xù)2w;正常對(duì)照組及模型組給予等量生理鹽水(NS);陽(yáng)性對(duì)照組大鼠每日肌肉注射MTX0.2mg/kg,連續(xù)2w。每隔兩日測(cè)定各組大鼠體重、左趾足趾腫脹度,并進(jìn)行關(guān)節(jié)評(píng)分。末次給藥后各組處死部分大鼠,分離脾臟,制備淋巴細(xì)胞懸液,觀察各組大鼠脾淋巴細(xì)胞增殖情況。取左后踝關(guān)節(jié)進(jìn)

4、行HE染色,觀察大鼠骨、關(guān)節(jié)軟骨組織破壞及炎性細(xì)胞浸潤(rùn)情況。分離大鼠骨髓來(lái)源DC,培養(yǎng)至第7d進(jìn)行混合淋巴細(xì)胞反應(yīng),研究DC功能變化。其余大鼠停藥一周繼續(xù)觀察。
　　(2)體外誘導(dǎo)小鼠骨髓CD11c+細(xì)胞,與不同濃度紅活麻總香豆素(1μg/ml、10μg/ml、50μg/ml、100μg/ml、150μg/ml)共培養(yǎng)。第7d檢測(cè)紅活麻總香豆素對(duì)樹(shù)突狀細(xì)胞表面抗原MHC-Ⅱ、共刺激因子CD86及程序性死亡配體-1(PD-L1)的影

5、響,噻唑藍(lán)(MTT)法檢測(cè)紅活麻總香豆素處理的DC在不同刺激比情況下體外刺激同種T細(xì)胞增殖的活性,確定紅活麻總香豆素體外影響DC表型和功能的最佳劑量;在紅活麻總香豆素作用于DC細(xì)胞基礎(chǔ)上,進(jìn)行PD-L1抗體(10μg/ml)阻斷,研究紅活麻總香豆素對(duì)DC的影響是否通過(guò)PD-1/PD-L1通路;紅活麻總香豆素(150mg/kg)灌胃給予Balb/c小鼠4w,流式細(xì)胞術(shù)(FACS)檢測(cè)藥物對(duì)小鼠CD4+CD25+Foxp3+Treg細(xì)胞分化

6、和CTLA-4表達(dá)的影響。
　　結(jié)果：(1)采用CⅡ乳劑可以建立Wistar大鼠膠原性關(guān)節(jié)炎模型,表現(xiàn)為大鼠四肢關(guān)節(jié)紅腫,行動(dòng)遲緩。與模型對(duì)照組比較,給藥組高、中、低三個(gè)劑量呈劑量依賴性的降低CIA大鼠的關(guān)節(jié)腫脹(P<0.05)和關(guān)節(jié)指數(shù)(P<0.05),其中高劑量組效果更為明顯,與陽(yáng)性藥MTX相當(dāng);HE鏡檢發(fā)現(xiàn),CIA模型組大鼠可見(jiàn)明顯的滑膜細(xì)胞增生和炎性細(xì)胞浸潤(rùn),骨及關(guān)節(jié)軟骨組織有明顯侵蝕損傷,紅活麻總香豆素治療后,可有效的減

7、少炎性細(xì)胞浸潤(rùn),骨及軟骨組織形態(tài)尚見(jiàn)完好,未見(jiàn)血管翳形成;停藥后一周,紅活麻總香豆素給藥組大鼠關(guān)節(jié)腫脹沒(méi)有復(fù)發(fā),預(yù)后效果良好;在ConA誘導(dǎo)的脾臟T淋巴細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)中,與CIA模型組相比,給藥高、中劑量組大鼠顯示出較為明顯的劑量依賴性抑制T細(xì)胞增殖的作用(P<0.05);混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)顯示給藥組大鼠DC在1:10的刺激比下均顯著降低對(duì)同種T細(xì)胞的增殖作用。
　　(2)FACS結(jié)果顯示,相比于對(duì)照組,紅活麻總香豆素(10μg/ml

8、～50μg/ml)可劑量依賴性的降低DC表面共刺激分子CD86及MHC-Ⅱ的表達(dá),下調(diào)DC對(duì)同種淋巴細(xì)胞增殖的能力,且刺激比為20:1時(shí)作用最為明顯,100μg/ml、150μg/ml紅活麻總香豆素體外影響DC表型和功能與50μg/ml紅活麻總香豆素作用相當(dāng),我們選取50μg/ml為紅活麻總香豆素體外最適宜濃度;在紅活麻總香豆素作用于DC細(xì)胞基礎(chǔ)上,進(jìn)行PD-L1抗體(10μg/ml)阻斷,發(fā)現(xiàn)PD-L1可有效的逆轉(zhuǎn)藥物對(duì)DC細(xì)胞表型和

9、功能的影響;體內(nèi)給予小鼠紅活麻總香豆素發(fā)現(xiàn),相比于空白對(duì)照組,紅活麻總香豆素可明顯上調(diào)小鼠DC細(xì)胞PD-L1的表達(dá)( P<0.05),且CD4+CD25+Foxp3+Treg細(xì)胞分化增加(P<0.05),CTLA-4表達(dá)上升。
　　結(jié)論：實(shí)驗(yàn)結(jié)果初步證明:
　　(1)紅活麻總香豆素具有抗大鼠CIA作用,表現(xiàn)出良好的免疫抑制作用。停藥后預(yù)后效果良好,對(duì)DC細(xì)胞的刺激功能有較強(qiáng)的抑制作用,提示其可能通過(guò)誘導(dǎo)免疫耐受發(fā)揮療效。