人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞對(duì)ITP的免疫抑制作用.pdf

1、第一部分CD70基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化在ITP發(fā)病機(jī)制中的作用
　　 研究背景：CD70(TNFSF7)，是一種甲基化敏感的免疫相關(guān)基因，在一些自身免疫性疾病中常常處于低甲基化的狀態(tài)。
　　 目的：研究在免疫性血小板減少(ITP)病人中，CD70基因的甲基化狀態(tài)及與調(diào)節(jié)甲基化水平的相關(guān)基因表達(dá)的關(guān)系。
　　 方法：我們用實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法及流式細(xì)胞儀檢測(cè)ITP病人和健康對(duì)照的CD4+T細(xì)胞中CD70基因mRNA和

2、蛋白水平的表達(dá)。用甲基化特異性高分辨率熔解(MS-HRM)的技術(shù)檢測(cè)CD70基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化水平。此外，CD4+T細(xì)胞中的三種DNA甲基轉(zhuǎn)移酶(DNMTs)及一種去甲基化酶(MBD2)的基因也通過(guò)實(shí)時(shí)定量PCR方法測(cè)定，以健康人CD4+T細(xì)胞作為對(duì)照。
　　 結(jié)果：結(jié)果顯示，CD70基因，DNMTI，DNMT3A，DNMT3B及MBD2基因的mRNA水平在ITP患者的外周CD4+T細(xì)胞比健康對(duì)照顯著增高。HRM方法測(cè)得ITP患

3、者的CD4+T細(xì)胞的CD70基因的啟動(dòng)子區(qū)甲基化水平比健康對(duì)照要低(p=0.147)。CD70基因的轉(zhuǎn)錄水平與其甲基化水平呈負(fù)相關(guān)，但是與幾種DNMTs的表達(dá)水平卻是呈顯著的正相關(guān)。
　　 結(jié)論：由此我們可以得出結(jié)論，DNA甲基轉(zhuǎn)移酶DNMTs可能也有如同MBD2一樣有去甲基化的功能，增加DNA甲基轉(zhuǎn)移酶DNMTs和MBD2都能導(dǎo)致CD70的低甲基化及過(guò)表達(dá)，從而對(duì)ITP的發(fā)病起著重要的作用。
　　 第二部分CD70和C

4、Dlla在ITP發(fā)病機(jī)制中作用的研究
　　 研究背景：ITP是一種血小板減少的自身免疫性疾病。而細(xì)胞自身反應(yīng)性發(fā)生的主要原因之一就是由于粘附分子的過(guò)表達(dá)而導(dǎo)致的。CD70和CDlla這兩種共刺激分子對(duì)T、B淋巴細(xì)胞的免疫功能很重要，CD70和CDlla分子的過(guò)表達(dá)還可以誘發(fā)很多自身免疫性疾病。
　　 目的：研究CD70與CDlla兩種免疫相關(guān)的共刺激分子對(duì)ITP發(fā)病機(jī)制的不同影響。
　　 方法：用real-tim

5、e PCR和流式細(xì)胞儀檢測(cè)ITP患者CD4+T細(xì)胞中CD70與CDlla mRNA與蛋白水平的表達(dá)變化，以健康人作對(duì)照。在培養(yǎng)的ITP患者和健康人外周血PBMC中分別加入anti-CDlla和anti-CD70單克隆抗體，設(shè)對(duì)照孔，一部分加入自體血小板共培養(yǎng)72小時(shí)后，用流式方法檢測(cè)CD4+T細(xì)胞，CD19+B細(xì)胞，CD8+T細(xì)胞及自體血小板的凋亡情況，并用ELISA方法檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清中IL-4，IFN-γ以及血小板相關(guān)IgG表達(dá)，另

6、一部分培養(yǎng)細(xì)胞用real-time PCR檢測(cè)GATA-3和T-bet的mRNA表達(dá)變化。
　　 結(jié)果：ITP患者CD4+T細(xì)胞中CD70與CDlla mRNA的表達(dá)水平和細(xì)胞表面的CD70與CDlla的表達(dá)較健康對(duì)照顯著增高。加入anti-CDlla和anti-CD70抗體的ITP患者培養(yǎng)細(xì)胞中，CD4+T細(xì)胞，CD19+B細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞的凋亡比不加抗體的對(duì)照顯著增多，而自體血小板凋亡數(shù)目明顯減少。特別是加入anti-C

7、Dlla抗體培養(yǎng)的細(xì)胞中，不僅CD19+B細(xì)胞幾乎全部凋亡，而且自體血小板凋亡比例也是最少的。但健康人各細(xì)胞及血小板凋亡差異并不顯著。細(xì)胞培養(yǎng)上清中IFN-γ在空白對(duì)照的細(xì)胞中表達(dá)最高，加入anti-CDlla和anti-CD70抗體的細(xì)胞都顯著降低，加入anti-CDlla抗體的細(xì)胞中IL-4的表達(dá)顯著增高。IgG的表達(dá)在各實(shí)驗(yàn)組中沒(méi)有顯著差異。GATA-3和T-bet的mRNA表達(dá)變化沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 結(jié)論：以上結(jié)果說(shuō)

8、明CD70與CDlla能促進(jìn)CD4+T細(xì)胞，CD19+B細(xì)胞及CD8+T細(xì)胞的存活，從而也間接促進(jìn)了自身抗血小板抗體的分泌。用anti-CDlla和anti-CD70單克隆抗體阻斷T細(xì)胞上的相關(guān)信號(hào)通路后，逆轉(zhuǎn)了ITP的Thl/Th2的極化狀態(tài)，極大地抑制了IFN-γ的分泌，特別是anti-CDlla，還能明顯促進(jìn)了IL-4的分泌，而且誘使大量的B細(xì)胞死亡，直接影響了血小板相關(guān)抗體的產(chǎn)生。我們認(rèn)為CD70與CDlla，特別是CDlla對(duì)

9、ITP的發(fā)病可能起著十分重要的作用。阻斷CDlla可能成為治療ITP的潛在途徑。
　　 第三部分Bmi-1對(duì)ITP病人的自身反應(yīng)性CD4+T細(xì)胞存活的調(diào)節(jié)作用
　　 研究背景：在免疫性血小板減少癥(ITP)患者的自身反應(yīng)性CD4+T細(xì)胞是呈快速的克隆性擴(kuò)增，而且具有凋亡抗性，在血小板減少中起著持續(xù)性的作用。已有的研究證明Bmi-1對(duì)于記憶性CD4+T細(xì)胞和效應(yīng)性CD8+T細(xì)胞的存活都是十分必要的。
　　 目的：由

10、于Bmi-1記憶性CD4+T細(xì)胞的存活和Th2細(xì)胞的增殖，我們假設(shè)Bmi-1可能在ITP患者的自身反應(yīng)性CD4+T細(xì)胞克隆性擴(kuò)增及Thl/Th2漂移的過(guò)程中起到作用。
　　 方法：我們用慢病毒載體包裝成含有Bmi-1編碼序列及shBmi-1干擾片段的成熟病毒顆粒，再分別感染ITP患者及健康對(duì)照的CD4+T細(xì)胞后，用BrdU及Annexin V對(duì)細(xì)胞染色后用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)在血小板刺激下的感染過(guò)或沒(méi)感染病毒的CD4+T細(xì)胞增殖及凋亡

11、情況。用ELISA方法檢測(cè)細(xì)胞因子分泌的變化。
　　 結(jié)果：我們的研究顯示急性ITP患者的CD4+T細(xì)胞比緩解期的病人及健康對(duì)照有較高的Bmi-1表達(dá)水平。自身反應(yīng)性CD4+T細(xì)胞相比健康對(duì)照有更強(qiáng)的增殖能力和抗凋亡能力。在感染包裝好的慢病毒后，結(jié)果顯示用短的發(fā)卡RNA抑制Bmi-1的表達(dá)后，可以導(dǎo)致ITP患者的自身反應(yīng)性CD4+T細(xì)胞增殖抑制而增加凋亡；同時(shí)，增加健康對(duì)照的CD4+T細(xì)胞的Bmi-1的表達(dá)可以促進(jìn)CD4+T細(xì)胞

12、的增殖并抑制凋亡。Bmi-1能促進(jìn)CD4+T細(xì)胞分泌IL-4。
　　 結(jié)論：這些結(jié)果說(shuō)明Bmi-1對(duì)于ITP患者的自身反應(yīng)性CD4+T細(xì)胞的克隆性擴(kuò)增能力及抗凋亡能力的增強(qiáng)起到重要作用。
　　 第四部分人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞對(duì)ITP的免疫抑制作用
　　 研究背景：入臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞(hUC-MSC)已經(jīng)在治療很多人類(lèi)的炎癥性疾病和自身免疫性疾病中顯現(xiàn)出了顯著的效果，主要是基于其較低的免疫原性和免疫抑制的潛能。但是在U

13、C-MSC治療免疫性血小板減少癥(ITP)病人的療效方面還未見(jiàn)報(bào)道。
　　 目的：UC-MSC對(duì)ITP病人在體內(nèi)和體外免疫抑制效果的研究和評(píng)估。
　　 方法：我們將從ITP病人和健康對(duì)照的外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMCs)與骨髓單個(gè)核細(xì)胞(BM-MNCs)分別UC-MSC共培養(yǎng)3天和7天。應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)和ELISA方法來(lái)檢測(cè)各項(xiàng)實(shí)驗(yàn)參數(shù)。
　　 結(jié)果及結(jié)論：結(jié)果顯示在來(lái)自于ITP病人的PBMCs中，自身反應(yīng)性T,B淋

14、巴細(xì)胞的增殖受到UC-MSC的明顯抑制，而與其自體血小板的破壞也得到明顯的緩解。UC-MSC不僅能抑制共刺激分子CD80，CD40和FasL在外周淋巴細(xì)胞表面的表達(dá)，而且還能改變Th1/Th2/Treg細(xì)胞因子的分泌特征。在ITP病人的骨髓單個(gè)核細(xì)胞中，UC-MSC可以顯著地逆轉(zhuǎn)巨核細(xì)胞異常的功能，能顯著促進(jìn)血小板的生成，并減少存活巨核細(xì)胞的比例，但同時(shí)也能抑制巨核細(xì)胞的早期凋亡。另外，BM-MNCs分泌TPO的水平也顯著增高。我們的臨

15、床研究顯示UC-MSC能夠有效緩解難治性ITP患者出血癥狀并使血小板水平增高。這些體內(nèi)外結(jié)果說(shuō)明UC-MSC細(xì)胞移植可能成為ITP的治療有效方法。
　　 第五部分異常信號(hào)通路導(dǎo)致的DNA低甲基化與自身免疫性疾病的關(guān)系
　　 DNA甲基化是基因組DNA一種主要的表觀(guān)遺傳修飾形式，主要在轉(zhuǎn)錄水平抑制基因的表達(dá)。異常的DNA低甲基化與人及小鼠的CD4+T細(xì)胞發(fā)生自身反應(yīng)性有關(guān)聯(lián)，DNA甲基化水平低是由于DNA甲基轉(zhuǎn)移酶（DNM

16、T）的表達(dá)下降所致。而DNMT的表達(dá)受ERK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的調(diào)控，ERK信號(hào)通路上游的蛋白激酶PKCδ的活化與否間接地影響到DNMT的表達(dá)，PKCδ磷酸化水平不足會(huì)導(dǎo)致ERK信號(hào)通路受損，最終下調(diào)DNMT的表達(dá)。在系統(tǒng)性紅斑狼瘡這樣的自身免疫性疾病中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)在CD4+T細(xì)胞中與免疫相關(guān)的甲基化敏感基因出現(xiàn)低甲基化及過(guò)度表達(dá)，主要包括黏附分子LFA-1和共刺激分子的受體CD70，CD40L等，這些分子過(guò)表達(dá)會(huì)使T細(xì)胞過(guò)度活化，并產(chǎn)生自身免疫