SDF-1α-Rac途徑在內(nèi)皮祖細(xì)胞極性調(diào)控與歸巢中的作用研究.pdf

1、近十幾年來(lái)，有關(guān)干細(xì)胞治療退行性疾病和壞死性疾病細(xì)胞替代療法的研究是熱點(diǎn)。在冠心病心肌梗死或心力衰竭的細(xì)胞治療中，細(xì)胞類型的選擇上，內(nèi)皮干/祖細(xì)胞是一個(gè)有希望的新生血管來(lái)源。但其“歸巢”和遷移機(jī)制復(fù)雜，目前歸巢和細(xì)胞再生能力差，未能臨床應(yīng)用。本研究擬從基礎(chǔ)研究為手段，探討新的hEPCs歸巢調(diào)控蛋白和可能的信號(hào)通路。
　　本研究擬驗(yàn)證Rac蛋白在EPCs歸巢中的重要作用，為冠心病的細(xì)胞治療提
　　供新的作用途徑。實(shí)驗(yàn)共分為以下

2、三個(gè)部分:
　　第一部分人內(nèi)皮祖細(xì)胞的培養(yǎng)與鑒定及大鼠內(nèi)皮祖細(xì)胞的培養(yǎng)
　　目的:建立本實(shí)驗(yàn)室離體人內(nèi)皮祖細(xì)胞（hEPCs，以后所出現(xiàn)EPCs，若無(wú)特殊說(shuō)明，都為本實(shí)驗(yàn)中分離出的hEPCs）培養(yǎng)的方法，探討培養(yǎng)條件、細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)、形態(tài)。與大鼠EPCs培養(yǎng)條件和生長(zhǎng)情況對(duì)比。方法:取人臍帶血80-120ml/袋，先分離單個(gè)核細(xì)胞，后使用磁珠細(xì)胞分選法，分選出CD133+/VEGFR2+的細(xì)胞，進(jìn)行流式細(xì)胞檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)雙陽(yáng)性細(xì)胞占

3、48.79％。用差速貼壁法培養(yǎng)1周，做常規(guī)拍照、免疫熒光染色拍照和細(xì)胞極性研究。結(jié)果:(1)此法提取的內(nèi)皮祖細(xì)胞平均產(chǎn)率在3％（EPCs占單個(gè)核細(xì)胞的比例）。在普通光鏡下呈索條狀、卵圓形。(2)細(xì)胞吞噬DII-acLDL、UEA染料后可在熒光顯微鏡下特異顯色，證明細(xì)胞有吞噬功能，推斷為EPCs。結(jié)論:(1)該方法培養(yǎng)hEPCs生長(zhǎng)活性好，在普通光鏡下呈索條狀、卵圓形?？梢杂糜谝院蟮募?xì)胞實(shí)驗(yàn);但較生長(zhǎng)狀態(tài)差于大鼠EPCs;(2)差速貼壁法

4、培養(yǎng)的hEPCs培養(yǎng)1周，可以吞噬DII-acLDL、UEA染料，呈特異顯色。
　　第二部分SDF-1α對(duì)人內(nèi)皮祖細(xì)胞極性和遷移的影響
　　目的:通過(guò)熒光顯微鏡觀察分離出的EPCs在SDF-1作用下極性和細(xì)胞骨架蛋白、受體分布的變化，通過(guò)細(xì)胞遷移板Zigmond chamber來(lái)觀察EPCs的遷移能力。方法:采用不同濃度的SDF-1α不同時(shí)間點(diǎn)與EPCs作用，觀察細(xì)胞形態(tài)，進(jìn)行細(xì)胞拍照。使用Fitc和主要觀察了三個(gè)指標(biāo):CD

5、133，GBP/Rac，F(xiàn)-actin（肌動(dòng)蛋白纖維或肌動(dòng)蛋白微絲）。結(jié)果:(1)光鏡下觀察，可見(jiàn)細(xì)胞形態(tài)變得細(xì)長(zhǎng)，胞體拉伸，出現(xiàn)兩極的“極化”現(xiàn)象。(2)細(xì)胞表面受體分布的變化，在SDF-1α作用組(25ng/ml，50ng/ml，100ng/ml，200ng/ml)1h、2h、6h、12h、24h時(shí)，CD133、GBP/Rac，F(xiàn)-actin的表達(dá)呈SDF-1劑量依賴（至少與空白對(duì)照組相比），即與SDF-1的濃度正相關(guān);其中在SDF

6、-1α200ng/ml的劑量組，CD133、GBP/Rac，F(xiàn)-actin在12小時(shí)時(shí)表達(dá)最高，而不是24小時(shí)。CD34的表達(dá)呈時(shí)間依賴，在24h時(shí)表達(dá)最高，而Rac1的表達(dá)不隨時(shí)間依賴，在12h時(shí)表達(dá)最高。細(xì)胞表面受體CXCR4、CD18、Integrinα4表達(dá)的研究中，CXCR4呈時(shí)間依賴，在24小時(shí)時(shí)表達(dá)最高，而CD18和Integrinα4的表達(dá)不呈時(shí)間依賴。(3)在Zigmond chamber趨化分析皿中觀察單個(gè)EPCs的

7、遷移（24小時(shí)內(nèi)）。通過(guò)建立總體EPCs的遷移的綜合向量（縱向Y和橫向X）分析，可以計(jì)算出EPCs遷移的角度和程度，定量證明了SDF-1作用下EPCs定向遷移能力加強(qiáng)。結(jié)論:EPCs在SDF-1誘導(dǎo)下極性發(fā)生了變化，無(wú)論在細(xì)胞形態(tài)還是細(xì)胞受體的分布均發(fā)生改變，同時(shí)EPCs的細(xì)胞群向SDF-1α方向發(fā)生了定向遷移。
　　第三部分SDF-1α對(duì)Rac蛋白調(diào)控分子機(jī)制的初步研究
　　目的:使用PCR測(cè)定SDF-1α誘導(dǎo)EPCs中R

8、ac1，Rac2表達(dá)，與第二部分受體分布中SDF-1濃度和隨時(shí)間變化結(jié)合，探索體外誘導(dǎo)最強(qiáng)“歸巢”能力hEPCs的SDF-1劑量和時(shí)間點(diǎn)。觀察SDF-1誘導(dǎo)Rac表達(dá)是否與CXCR4和p38MAPK有關(guān)。方法:分為用SDF-1在不同的干預(yù)時(shí)間點(diǎn)(1h，2h，6h，12h，24h)與 hEPCs共培養(yǎng)后，提取細(xì)胞Rac RNA測(cè)定其mRNA的表達(dá)變化，同時(shí)測(cè)定Rac蛋白及Rac-GTP蛋白的表達(dá)變化。分別使用CXCR4的抑制劑AMD310

9、0和p38MAPK的阻斷劑SB203580干預(yù)SDF-1和hEPCs的共培養(yǎng)，測(cè)定Rac蛋白及Rac-GTP蛋白的表達(dá)變化。結(jié)果:PCR電泳圖譜觀察到rac1和rac2都是在12小時(shí)表達(dá)量最高。而探究SDF-1α與EPCs中Rac蛋白及Rac-GTP蛋白表達(dá)的關(guān)系，根據(jù)western的OD值計(jì)算，在12小時(shí)Rac及其活化的Rac表達(dá)最高。加入CXCR4的抑制劑AMD3100后，rac1和rac2蛋白表達(dá)的抑制率分別為:57.1％和62.

10、2％。加入p38MAPK的抑制劑，即為SB203580后明顯抑制了SDF-1α誘導(dǎo)的Rac-1和Rac-2蛋白表達(dá)。結(jié)論:(1)調(diào)控Rac表達(dá)的最佳SDF-1濃度為200ng/ml，最佳時(shí)間點(diǎn)為12小時(shí);(2) SDF-1α調(diào)控Rac的表達(dá)是CXCR4和p38MAPK依賴的。
　　結(jié)論
　　1.人EPCs在SDF-1α誘導(dǎo)下（分1h、2h、6h、12h、24h五個(gè)時(shí)間點(diǎn)）極性發(fā)生了變化，無(wú)論在細(xì)胞形態(tài)還是細(xì)胞受體的極化均發(fā)生

11、改變，同時(shí)EPCs的細(xì)胞群向SDF-1α方向發(fā)生了定向遷移。
　　2.在200ng/mlSDF-1作用下，Rac蛋白在的亞型rac1和rac2其mRNA和蛋白都是在12小時(shí)表達(dá)量最高。加入CXCR4的抑制劑AMD3100，Rac1和Rac2蛋白表達(dá)明顯減少;加入p38MAPK的抑制劑SB203580后Rac-1和Rac-2的表達(dá)亦明顯減少，說(shuō)明SDF-1α上調(diào)Rac表達(dá)，是CXCR4和p38MAPK信號(hào)通路依賴的。
　　潛在