SDF-1調(diào)控表皮干細(xì)胞生物學(xué)功能的初步研究.pdf

1、皮膚組織有著很強(qiáng)的再生能力,表皮基底層中的干細(xì)胞終身不斷自我更新、持續(xù)分化以取代終末分化細(xì)胞,從而進(jìn)行組織結(jié)構(gòu)的更新。終末分化細(xì)胞的死亡、脫落與基底干細(xì)胞的分裂維持一定的平衡,這是維持正常的表皮組織結(jié)構(gòu)和細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的基本要求[1]。隨著分子生物學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、組織工程學(xué)及生物工程學(xué)等學(xué)科的發(fā)展,表皮干細(xì)胞(Epidermal stem cell,ESC)憑借其特有的生物學(xué)優(yōu)勢(shì)在基因治療、細(xì)胞治療中越來(lái)越受到重視,成功地分離、培養(yǎng)表皮

2、干細(xì)胞對(duì)臨床上創(chuàng)傷修復(fù)、皮膚癌的研究也起著至關(guān)重要的作用[2-8]。
　　 皮膚創(chuàng)面的修復(fù)是一個(gè)多細(xì)胞與細(xì)胞因子參與的復(fù)雜過(guò)程。創(chuàng)傷早期,創(chuàng)緣周?chē)a(chǎn)生大量滲出液,多種細(xì)胞因子可能調(diào)節(jié)創(chuàng)傷修復(fù)過(guò)程中的細(xì)胞反應(yīng),影響細(xì)胞增殖、遷移、細(xì)胞外基質(zhì)合成和釋放等。
　　 間質(zhì)細(xì)胞衍生因子-1(stromal cell-derived factor-1,SDF-1)是由間質(zhì)細(xì)胞分泌,并被證實(shí)在多種成體組織損傷修復(fù)過(guò)程中介導(dǎo)成體干細(xì)胞向

3、受損區(qū)域遷移,參與創(chuàng)傷修復(fù)。因此我們推測(cè)SDF-1很可能在皮膚組織創(chuàng)傷后也有表達(dá),并進(jìn)而影響表皮干細(xì)胞在創(chuàng)緣的分布變化及數(shù)量改變。
　　 目的：
　　 1.利用改良的人胎盤(pán)Ⅳ型膠原快速粘附法從人包皮組織獲得ESC并進(jìn)行無(wú)血清培養(yǎng),觀察其體外培養(yǎng)的生長(zhǎng)特點(diǎn),尋求一種理想的人ESC體外分離培養(yǎng)技術(shù)。
　　 2.觀察SDF-1對(duì)體外培養(yǎng)的人ESC增殖、遷移等生物學(xué)活性的影響,并初步探討其作用機(jī)制。
　　 3.以

4、ESC為種子細(xì)胞構(gòu)建三維皮膚等價(jià)物(thee-dimensional skin equivalents,TDSE)全層創(chuàng)傷模型,觀察皮膚創(chuàng)面發(fā)生過(guò)程中創(chuàng)緣SDF-1的表達(dá)及ESC的動(dòng)態(tài)變化,分析二者相關(guān)性。
　　 方法
　　 1.按照DispaseⅡ-胰酶兩步消化法從人包皮組織獲得ESC,以人胎盤(pán)Ⅳ型膠原按照5μ/cm2的密度包被培養(yǎng)瓶,將ESC以無(wú)血清培養(yǎng)基(defined keratinocyte-serum fre

5、emedium,DK-SFM)進(jìn)行體外培養(yǎng),觀察其生長(zhǎng)及形態(tài)變化、克隆形成,并對(duì)原代培養(yǎng)的ESC表面標(biāo)記物β1-integrin、CK19、PCNA進(jìn)行細(xì)胞免疫組織化學(xué)染色,對(duì)CD49f和分化標(biāo)記CD71雙染進(jìn)行免疫熒光鑒定。
　　 2.通過(guò)MTT實(shí)驗(yàn)檢測(cè)不同濃度SDF-1對(duì)ESCs增殖的影響,以及在相同濃度SDF-1作用下另添加不同濃度AMD3100對(duì)ESCs增殖的影響;通過(guò)劃痕實(shí)驗(yàn),檢測(cè)不同濃度SDF-1對(duì)ESCs趨化遷移的

6、作用趨勢(shì),及SDF-1促遷移運(yùn)動(dòng)的時(shí)間效應(yīng)。
　　 3.將成纖維細(xì)胞與鼠尾膠原、DMEM培養(yǎng)基、血清按比例混勻制成“真皮等價(jià)物”。經(jīng)過(guò)72h培養(yǎng),原代人角質(zhì)形成細(xì)胞接種在真皮等價(jià)物的表面。繼續(xù)培養(yǎng)1周后,抬高到氣-液面,使ESC分化為各層,最終形成“三維皮膚等價(jià)物”隨后,用液氮冷凍的金屬棒凍傷模型,建立離體全層凍傷創(chuàng)面。在凍傷后3、7天、10天取材免疫組化染色觀察創(chuàng)緣SDF-1的表達(dá)變化;另添加外源性SDF-1和其受體阻斷劑AM

7、D3100作用后,在凍傷后3、7天取材免疫組化染色觀察創(chuàng)緣ESCs的分布變化。
　　 結(jié)果：
　　 1.Ⅳ型膠原分選的粘附細(xì)胞在DK-SFM培養(yǎng)基中生長(zhǎng)良好,細(xì)胞胞體呈圓形,細(xì)胞核大,核質(zhì)比大,培養(yǎng)9天能行成含200個(gè)細(xì)胞以上的大克隆,呈鋪路石樣鋪滿瓶底。Β1-integrin、CK19、PCNA均呈陽(yáng)性表達(dá)。免疫熒光法雙重標(biāo)記顯示細(xì)胞為α6briCD71dim細(xì)胞。
　　 2.SDF-1α濃度依賴性的促進(jìn)ESC

8、的增殖、遷移作用。在100ng/ml時(shí)促增殖和遷移的作用最顯著,AMD3100則能有效阻斷上述增殖和遷移的作用。
　　 3.利用ESC為種子細(xì)胞成功構(gòu)建了三維皮膚等價(jià)物全層凍傷模型。HE染色顯示正常未凍傷區(qū)細(xì)胞分層良好,凍傷創(chuàng)緣區(qū)表皮細(xì)胞壞死增多,表皮層變薄。免疫組織細(xì)胞化學(xué)染色顯示,凍傷發(fā)生后,創(chuàng)緣周?chē)M織中SDF-1表達(dá)量不斷增加。但是表達(dá)量的增加不是持續(xù)的,第7天即為高峰,隨后表達(dá)量迅速減少。至愈合晚期,局部無(wú)SDF-1表

9、達(dá)。伴隨創(chuàng)面愈合進(jìn)程,ESC的定位分布不象正常皮膚那樣呈單層片狀、散在分布于表皮基底層,而是向創(chuàng)面遷移聚集的趨勢(shì)更加明顯,且在多層內(nèi)出現(xiàn)散在β1整合素陽(yáng)性細(xì)胞。組織形態(tài)學(xué)上表現(xiàn)為新生表皮組織較正常組織明顯增厚。
　　 結(jié)論：
　　 1.對(duì)人ESC的體外無(wú)血清培養(yǎng)方法進(jìn)行觀察發(fā)現(xiàn)通過(guò)Ⅳ型膠原快速粘附法能有效的分離ESC。
　　 2.外源性的SDF-1α對(duì)ESC增殖和遷移的促進(jìn)作用,這些影響是通過(guò)SDF-1α及其受體